雞胚成纖維細胞在體外篩選CpG寡聚脫氧核苷酸活性分子中的應用

雞胚成纖維細胞在體外篩選CpG寡聚脫氧核苷酸活性分子中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞生物學和免疫學技術，特別涉及生物制品領域免疫佐劑的體外細 胞篩選技術，具體涉及雞胚成纖維細胞在體外篩選CpG寡聚脫氧核苷酸活性分子中的應用。
【背景技術】
[0002] CpG寡脫氧核苷酸(CpG oligonucleotide，CpG 0DN)是含有未甲基化的CpG二核苷 酸基序的核苷酸序列，能夠在機體內誘生強烈的免疫反應。CpG 0DN首先激活Toll樣受體9/ 21(toll-like receptor 9/21，TLR-9/21)，而后經一系列信號轉導誘導機體B細胞增殖分 化，刺激自然殺傷(NK)細胞的免疫保護活性;促進樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞等的抗 原遞呈功能;激發T細胞活性，產生免疫調節級聯反應。產生的效應物質中除免疫球蛋白外， 還包括Thl和Th2型細胞因子、前炎癥細胞因子以及趨化因子，具有顯著增強抗原體液免疫 和細胞免疫的作用。研究表明，人工合成的含未甲基化CpG基序的CpG 0DN和細菌DNA-樣， 同樣具有很強的免疫作用。
[0003] CpG 0DN的免疫刺激作用具有種屬特異性，雞的最佳刺激基序為5'-GTCGTT-3'。天 然的CpG 0DN進入體內和細胞后極不穩定，易受細胞內和血清中核酸水解酶的降解，B型CpG 0DN半衰期僅5min左右，C型也不過60min，因此在人工合成時多將CpG 0DN進行部分或者全 鏈的硫代修飾以防止序列的降解。然而，序列的硫代修飾往往會產生非特異性的細胞毒性 作用，影響細胞存活率，干擾試驗結果。目前，體外篩選和研究CpG 0DN多用外周血分離的單 核細胞或者脾臟分離的淋巴細胞，其作用效應顯著，但耐受細胞毒性的閾值較低，當CpG 0DN達到20yg/mL(雞脾臟細胞濃度為5*106)時即出現細胞毒性的抑制作用，極大限制了 CpG 0DN最優工作濃度的全面篩選。

【發明內容】

[0004] 為了解決以上現有技術中淋巴細胞用于CpG 0DN體外篩選和研究時耐受細胞毒性 的閾值較低，無法全面準確獲得最優工作濃度的問題，本發明提供了一種應用耐受力強的 雞胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)進行CpG 0DN體外篩選的方法。當CpG 0DN濃度大于80yg/mL(雞脾臟細胞濃度為5*106)時，可作為宿主免疫應答研究起始點的雞 胚成纖維細胞(chicken embryo fibroblast，CEF)才表現出細胞損傷，增殖率受到影響。基 于此，我們以耐受力強的CEF為模型，通過測定細胞增殖和免疫應答效果進行CpG 0DN活性 分子的篩選，旨在建立利用CEF體外篩選CpG 0DN的體系，為體外篩選CpG 0DN提供更適合的 手段和方法。
[0005] 本發明的目的是首先確定CpG 0DN刺激CEF產生的免疫反應能夠正確體現序列結 構對其活性的影響。
[0006] 本發明的另一目的是提供一種優于利用雞淋巴細胞體外篩選CpG 0DN活性分子的 新方法。
[0007] 本發明所述的確定CpG 0DN刺激CEF產生的免疫反應能夠正確體現序列結構對其 活性的影響是通過測定不同序列CpG 0DN對CEF的增殖效果和相關免疫基因 mRNA表達量的 變化來實現的。
[0008] 本發明是通過以下步驟得到的：
[0009] 雞胚成纖維細胞在體外篩選CpG寡聚脫氧核苷酸活性分子中的應用。
[0010] 所述的應用，具體操作為待雞胚成纖維細胞生長為單層細胞后與CpG寡聚脫氧核 苷酸共孵育，放入細胞培養箱培養。
[0011] 所述的應用，雞胚成纖維細胞對不同結構CpG寡聚脫氧核苷酸刺激所產生的增殖 效果與淋巴細胞具有相同的規律。
[0012]所述的應用，優選CpG寡聚脫氧核苷酸序列為序列表中序列1-9中任一項序列。 [0013]所述的應用，優選CpG寡聚脫氧核苷酸工作濃度20yg/mL。
[0014] 所述的應用，雞胚成纖維細胞受到CpG寡聚脫氧核苷酸刺激后引發的免疫反應強 于淋巴細胞。
[0015] 所述的應用，CpG寡聚脫氧核苷酸刺激雞胚成纖維細胞后，免疫基因的表達增加量 高于或接近于使用淋巴細胞的表達增加量。
[0016] 所述的應用，優選免疫基因為11^-2、幾-6、11^-12、正^€[、正1丫或1'1^-21基因。 [0017]雞胚成纖維細胞對硫代CpG寡聚脫氧核苷酸的耐受濃度為80yg/mL。
[0018]本發明的有益效果：
[0019] CEF用于CpG 0DN的體外篩選不僅避免了核酸序列細胞毒性的干擾問題，對硫代 CpG寡聚脫氧核苷酸的耐受濃度為80yg/mL，擴大了CpG 0DN的濃度篩選范圍，還正確區分體 現了CpG 0DN的結構與功能，與淋巴細胞相比，其免疫反應更強，更適合于CpG 0DN免疫佐劑 的體外篩選。
【附圖說明】
[0020] 圖1為CpG 0DN對IL-2表達量的影響，
[0021] 圖2為CpG 0DN對IL-12表達量的影響，
[0022] 圖3為CpG 0DN對IL-6表達量的影響，
[0023] 圖4為CpG 0DN對IFN-α表達量的影響，
[0024] 圖5為CpG 0DN對IFN-γ表達量的影響，
[0025] 圖6為CpG 0DN對TLR-21表達量的影響，
[0026]圖7為硫代CpG 0DN濃度對CEF增殖能力的影響。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明：
[0028] 實施例1
[0029] 1.1測定不同序列CpG 0DN對CEF的增殖效果。根據CpG 0DN的設計原則共設計序列 9條，其中A型2條，B型3條，C型3條，陽性、陰性對照各1條，序列如表1，分別對應序列表中的 序列1-9。
[0030]表 1 CpG 0DN序列
[0031]
[0032] 然后將制備好的CEF密度調整為1*107個/mL，加入96孔細胞板，每孔100yL，置于37 °C、5 %⑶2細胞培養箱中培養24h，使CEF貼壁并生長成單層細胞。將CpG 0DN1-9用細胞培養 液稀釋后分別加入細胞孔中，每孔終體積120yL，CpG工作濃度選擇20yg/mL(便于與淋巴細 胞比較），輕輕混勻后放入細胞培養箱培養48h。每條CpG 0DN重復5孔，同時添加 roS替代CpG 0DN的陰性對照和無細胞的DMEM空白對照。在培養終止前4h，每個細胞孔加入MTT 10yL，繼 續孵育4h，取出后棄上層營養液，按100μL7孔加入DMS0，置于搖床上晃動lOmin，使結晶紫完 全溶解。然后酶標儀上測定各孔0D490的值。
[0033] 各CpG 0DN作用于CEF的效果以刺激指數(stimulation index,SI)來衡量，其計算 方法為SIGPGQDN=(0DGPGQDN-0D??(f^?)/(0D陰斷r0D??(#,?)。計算不同序列CpG0DN刺激下CEF增 殖樣品的0D490平均值，并得到相應的刺激指數。如表2所示，與無活性的CpG 0DN9、陰性對 照和空白對照相比，CpG 0DN1-8均可有效刺激細胞增殖，SI指數接近2,與CpG 0DN9差異顯 著(P〈0.05)，其中CpG 0DN4、CpG 0DN6刺激效果最好，指數分別達到2.349、2.376。
[0034] 表2不同序列CpG 0DN的刺激指數 [0035]
[0036] CpG 0DN序列中凡含CpG基序的均能夠刺激CEF的增殖，CpG 0DN9因序列中CG堿基 倒置而喪失刺激活性，甚至低于陰性對照值。CpG 0DN6和CpG 0DN4刺激指數最高，其序列內 部均含有回文序列，且序列5'端以TCG開頭，不同之處在于CpG 0DN6的回文序列在5'端且包 含4個CpG基序，而CpG 0DN4回文序列靠近中部且只含3個CpG基序，所以CpG 0DN6的活性強 于CpG 0DN4<XpG 0DN5也含有回文序列，與CpG 0DN4不同在于回文序列中含GTCGTT，但刺激 活性并未增強，回文序列中的GTCGTT不起促進作用。CpG 0DN1即CpG2006，其對雞的淋巴細 胞具有很好的刺激作用，作用于CEF的刺激效果也很明顯，與淋巴細胞反應一致。CpG 0DN2 比CpG 0DN1減少一組GTCGTT，其活性也相應降低。多個TCG重復序列有助于增強CpG 0DN對B 細胞和NK細胞的刺激作用，CpG 0DN3即為7個TCG的簡單重復，具有良好的刺激活性，這與已 有的淋巴細胞研究結果一致。磷酸骨架的CpG 0DN序列3'端的poly G尾能與單核細胞表面 的清道夫受體結合，它所形成的四聚體結構可以使CpG 0DN的結合和吞入過程變得更加容 易，CpG 0DN7和CpG 0DN8的序列3'端含有poly G尾，雖然未以TCG開頭，但其刺激活性依然 有所增強，高于CpG 0DN1。此外，CpG 0DN7相比CpG 0DN8序列中還加入了 12bp的回文序列， 對活性也有較好的提升作用。可見，CEF對不同序列CpG 0DN刺激所產生的增殖效果與淋巴 細胞具有相同的規律，具有很好的區分度，準確反應了 CpG 0DN的結構特征。
[0037] 2.2測定不同序列CpG 0DN刺激CEF相關免疫基因 mRNA表達量的變化。熒光定量檢 測目的基因有11^-2、幾-6、11^-12、正^€[、1?^丫和1'1^-21，0-厶(^11為內參基因，引物序列如 表3,分別對應序列表中的序列10-23。
[0038]表3熒光定量檢測基因引物序列
[0039]
[0040]
[0041 ] CpG 0DN刺激CEF的操作同CEF增殖試驗，同時設置PBS未處理組對照。待作用24h 后，取出細胞反復凍融3次，使細胞從板上脫落，吸出后進行RNA的提取。應用Trizol法提取 細胞的總RNA，然后進行反轉錄。向11.5yL的RNA溶液中加入lyL 25pmol/L的01igo(dT)18,70 °C保溫lOmin后，冰上急冷2min。然后加入5*M-MLV Buffer 4yL，dNTP Mixture(10mM)2yL， RTase M-MLV 0.5yL，RNase Inhibitor(RRI)lyL，反應條件為：室溫 10min，42°Clh，7(rC 15min。獲得反轉錄一鏈用于焚光定量PCR的檢測。檢測采用相對定量方法，以β-actin為內 參基因。7個基因 PCR反應條件相同，95°C預變性2min; 95°C 10