細胞黏附力的檢測方法及細胞探針固定支架的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種細胞黏附力的檢測方法及細胞探針固定支架。
【背景技術】
[0002]口腔菌斑生物膜是齲病和牙周病的始動因素，細菌黏附到固體表面的過程是生物膜形成的關鍵，是微生物研究的關鍵問題之一。目前細菌黏附的機制還未完全明確，在整個細菌黏附和牙菌斑生物膜形成的發生、發展過程中，細菌黏附力具有重要的作用，它決定了細菌生長及脫落的動態平衡。為控制牙菌斑生物膜的形成，國內外科學工作者已關注對口腔細菌黏附力及生物膜力學的深入探討。
【發明內容】
[0003]本發明旨在提供一種細胞黏附力的檢測方法，采用原子力顯微鏡在近生理條件下定量檢測多細菌及單細菌的黏附力，分析細菌黏附行為，可用于材料的抗菌性評價，為菌斑生物膜的形成機制研究提供新的方法和思路;本發明同時公開了一種適用于本檢測方法的細胞探針固定支架。
[0004]為達到上述目的，本發明是采用以下技術方案實現的:
[0005]本發明公開的細胞黏附力的檢測方法，包括以下步驟:
[0006]a、制備多細菌探針和/或單細菌細胞探針樣本；
[0007]b、采用接觸模式對多細菌探針和/或單細菌細胞探針樣本進行AFM測量，獲取隨時間變化的力-距曲線；
[0008]C、根據細菌細胞熒光染色、電鏡圖片及力-距曲線形態判斷細菌探針質量，去除無效曲線后讀取粘附峰的最大值，即為該樣本表面與細胞的粘附力。
[0009]進一步的，在步驟a中，所述多細菌探針的制備方法包括:將探針在紫外光下消毒，在顯微鏡下通過固定支架將探針浸入多聚-L-賴氨酸溶液中，取出后在層流通風櫥中晾干，再將探針浸入細菌懸液吸收。
[0010]優選的，在步驟a中，所述單細菌細胞探針的制備方法包括:所述單細菌細胞探針采用無尖探針，采用UV固化的膠水將直徑4?6.1um的SciI ica球固定于無尖探針上，在細菌懸液中固定單細菌于Sci Iica球的頂端。
[0011]優選的，所述無尖探針為采用多巴胺對膠體探針進行表面生物改性得到；固定Scilica球、單細菌時均采用原子力顯微鏡控制探針。
[0012]優選的，在步驟b中，原子力顯微鏡的參數設定為掃描頻率0.5Hz，掃描距離1.5um；每個多細菌探針和/或單細菌細胞探針在樣本表面隨機選取3個點進行掃描，每點重復測量10次，每個樣本共獲得30個力-距離曲線。
[0013]進一步的，步驟c中還包括:根據泊松分布分解為非特異性力和特異性力，得到不同黏附時間點的力的分布。
[0014]進一步的，步驟c中還包括:根據單細菌細胞探針樣本的力-距曲線，獲得細胞表面的彈性模量，結合探針與細胞的粘附力，獲得生物膜的力分布圖。
[0015]本發明還公開了一種適用于所述細胞黏附力的檢測方法的細胞探針固定支架，包括懸臂，所述懸臂一端與安裝座連接，懸臂自由端的端面開設V型開口，所述懸臂自由端的頂面設有龍門，所述龍門跨設在V型開口上方，龍門的一個支撐柱與懸臂自由端的頂面固連，龍門的另一個支撐柱與懸臂自由端的頂面之間留有間隙。
[0016]進一步的，所述安裝座包括底座、支撐板、壓板和墊板，所述支撐板的底面連接底座的頂面，所述墊板的底面連接支撐板的頂面，所述壓板的底面連接墊板的頂面，支撐板、壓板的一端均超過墊板，支撐板、壓板超過墊板部分均設有螺紋孔，支撐板、壓板上的螺紋孔上下正對，所述懸臂設有條形孔，所述條形孔的長邊方向與懸臂的軸線方向相同。
[0017]進一步的，所述懸臂分為前后兩段，前后兩段之間通過阻力鉸鏈連接，所述龍門為彈性材質。
[0018]本發明在近生理條件下檢測細菌對口腔材料的黏附力，通過對力-距曲線的統計學分析，研究不同細菌對口腔材料初期黏附、黏附強化及細菌集聚的機制;分析生物膜形成早期到成熟階段的形貌及細菌細胞的黏附力，獲得生物膜表面的力分布圖，討論影響生物膜形成及處理的因素;綜合菌斑生物膜的黏附能，探討口腔材料表面菌斑生物膜形成的機制。本課題有助于口腔材料種類和表面設計優化，減少細菌黏附，控制牙菌斑的形成，降低齲病與牙周病的發病率;通過分析黏附力及黏附能研究細菌黏附過程，為菌斑生物膜的形成機制研究提供新的思路。
【附圖說明】
[0019]圖1為細胞探針固定支架的結構示意圖；
[0020]圖2為圖1的俯視圖；
[0021]圖中:1-探針頭部、2-探針尾部、3-V型開口、4-懸臂、5-條形孔、6_壓板、7_龍門、8_支撐板、9-螺紋孔、10-擋板、11-底座、12-螺栓、71 -龍門的一個支撐柱、72-龍門的另一個支撐柱。
【具體實施方式】
[0022]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖，對本發明進行進一步詳細說明。
[0023]本發明公開的細胞黏附力的檢測方法，包括以下步驟:
[0024]1、多細菌探針的制備:細菌固定于探針的方法步驟包括細胞培養、離心、超聲等，獲得細胞懸液。將細菌固定于無尖探針上，固定前探針在紫外光下消毒，在顯微鏡下通過自制的固定支架將探針浸入多聚-L-賴氨酸(PLL)溶液中，取出后在層流通風櫥中晾干，再將探針浸入細菌懸液吸收，多細菌探針制備成功后立即用于AFM測量。
[0025]2、建立了單細菌細胞力學測試平臺(single-cell force spectroscopy SCFS):單細菌細胞力學測試的關鍵在于細菌細胞的固定，需采用特定的原子力顯微鏡探針，如膠體探針。通過原子力顯微鏡的輔助，采用UV固化的膠水將直徑4-6.1um的Scilica球固定于無尖探針上，自制膠體探針，采用多巴胺對膠體探針進行表面生物改性，采用原子力顯微鏡控制探針，在細菌懸液中固定單細菌于膠體球的頂端，制得單細菌細胞探針。
[0026]3、力-距曲線的測量:在接觸模式下測量，將制備好的細胞探針加載于AFM的探針架，將待測材料固定于液體池底部，調整AFM參數，在黏附緩沖液中完成力-距曲線的測量，并通過軟件控制細菌探針在材料表面停留的時間獲得不同黏附時間的力-距曲線。
[0027]具體的，采用SPM-9600島津掃描探針顯微鏡在接觸模式下測量，將制備好的細胞探針加載于AFM的探針架上并放入原子力顯微鏡中。將材料試件固定于液體池底部中間，并放于原子力顯微鏡載樣臺上。調整激光強度后使探針靠近樣品表面，往液體池內注入粘附緩沖液，浸沒過顯微鏡探針支架及樣本表面，調整顯微鏡各項參數后進行粘附力的測量。測量條件:室溫，粘附緩沖液中，接觸模