使用連續培養制備乙醇的方法和連續培養裝置的制造方法
【專利說明】使用連續培養制備乙醇的方法和連續培養裝置
[0001] 發明背景 1.發明領域
[0002] 本發明涉及使用連續培養制備乙醇的方法，其中使用具有木糖代謝能力的重組微 生物；和涉及連續培養裝置。
[0003] 2.相關技術的描述
[0004] 木素纖維素中含有的主要糖類包括構成纖維素的葡萄糖和構成半纖維素的木糖。 當化學地或者酶促地分解木素纖維素時，獲得了含有主要組分是單糖的糖化組合物，所述 單糖如葡萄糖和木糖。為了自木素纖維素工業制備有用物質，需要能夠通過有效利用糖化 組合物中含有的糖類，以高產量和高生產率發酵的微生物和制備方法。
[0005] 例如，將編碼木糖異構酶（XI)、木糖還原酶（XR)和木糖醇脫氫酶（XDH)的基因轉 移至具有高乙醇發酵能力的酵母如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)中，以對酵母賦 予木糖利用能力。使用這種酵母，通過有效利用衍生自木素纖維素的糖類能夠制備乙醇。
[0006] 通常，通過使用微生物來發酵物質的制備方法中，已知有分批培養、連續培養和流 加培養（補料分批培養）。在分批培養中，對每一工藝制備新的培養基，將微生物接種至制 備的培養基，且至培養結束時不添加另一培養基。在分批培養中，每一培養的品質是變化 的，但是能夠分散和降低污染的風險。在連續培養中，將培養基以恒定的速度提供給培養體 系，并同時以相同的速度從培養體系取出培養液。連續培養的特征在于易于維持恒定的培 養環境且生產率是穩定的。在流加培養中，將培養基或培養基的特定組分在培養期間添加 至培養體系，并且直至培養結束時才從培養體系提取所獲得的產物。
[0007] 特別地，關于連續培養，日本專利申請公開號2009-065970 (JP 2009-065970 A)公 開了通過連續發酵制備化學品的方法，其中在簡單的操作條件下能夠長時間穩定地維持高 生產率。在JP 2009-065970 A公開的方法中，通過多孔膜過濾發酵培養液，并將微生物等 從發酵培養液提取至體系外。但是，在這個方法中，當使用基于木素纖維素的材料時，產生 了多孔膜的堵塞，并且問題是需要高的花費來解決堵塞。
[0008] 日本專利申請公開號2010-227074(JP 2010-227074 A)公開了通過醇發酵連續制 備乙醇的方法，其中使用了酵母，以含淀粉物質作為基質。在JP 2010-227074 A公開的方法 中，將連續發酵條件控制為特定值，其中所述連續發酵條件包括發酵溫度、基質供給速度、 發酵液提取速度、氣流速度和酵母濃度，并將發酵液中的乙醇濃度維持在預定值或以下。根 據JP 2010-227074 A中公開的方法，能夠有效地繼續乙醇的產生，且在連續發酵期間無需 額外地提供酵母。但是，在JP 2010-227074 A中公開的所述連續培養方法中，當使用衍生 自木素纖維素的糖類作為基質時，存在不能有效產生乙醇的問題。
[0009] 發明概述
[0010] 如上所述，在相關領域中，不能通過使用具有木糖利用能力的微生物從衍生自木 素纖維素的糖類有效產生乙醇。考慮到上述情形，本發明提供了通過使用具有木糖利用能 力的微生物的連續培養從衍生自木素纖維素的糖類實現有效產生乙醇的方法和裝置。
[0011] 作為深入研究的結果，本申請的發明人發現在使用具有木糖利用能力的微生物的 連續培養中，通過以培養液中的木糖濃度作為指標來控制培養基添加，能夠有效制備乙醇， 由此完成了本發明。
[0012] 根據本發明的一個方面的乙醇的制備方法包括：測定含有具木糖利用能力的微生 物的培養液中的木糖濃度，所述培養液包括含有衍生自木素纖維素的糖類的培養基；和實 施添加控制，其中將額外培養基添加至所述培養液以進行微生物的連續培養，所述額外培 養基含有衍生自木素纖維素的糖類。在根據本發明上述方面的制備乙醇的方法中，添加控 制可以包括添加額外培養基至培養液，以調節木糖濃度為預先設定的閾值或以下。在根據 本發明上述方面的制備乙醇的方法中，所述預先設定的閾值可以是培養開始前的培養液中 木糖濃度的1/3或以下。在根據本發明上述方面的制備乙醇的方法中，所述預先設定的閾 值可以是l〇g/L或以下。在根據本發明上述方面的制備乙醇的方法中，所述添加控制可以 包括控制所述額外培養基向所述培養液的供給速度，使得所述連續培養中每單位時間和單 位液量產生的用于乙醇制備的微生物細胞數多于使用所述培養基的分批培養中每單位時 間和單位液量產生的用于乙醇制備的微生物細胞數。在根據本發明上述方面的制備乙醇的 方法中，所述供給速度大于可以自下述等式獲得的F :
[0013] F = VX (xnax-x〇)/xsXT/(tbatchX (T-t,))
[0014] 其中F表示所述額外培養基的供給速度，V表示所述培養液的液量，x_表示使用 所述培養基的分批培養中的用于乙醇制備的最大微生物濃度，&表示使用所述培養基的分 批培養開始時的用于乙醇制備的微生物濃度，x s表示使用所述培養基的連續培養穩態時的 用于乙醇制備的微生物濃度，T表示在所述培養液中維持穩態的時間，t bateh表示使用所述培 養基的分批培養所需的總時間，和^表示在使用所述培養基的連續培養中，至建立穩態時 所需的總時間。在根據本發明上述方面的制備乙醇的方法中，可以對所述供給速度進行控 制，使得所述培養液中的木糖濃度是在使用所述培養基的分批培養結束時培養液中木糖濃 度的10倍或以下。在根據本發明上述方面的制備乙醇的方法中，所述培養基可以含有對木 素纖維素使用稀酸蒸煮處理后、進行糖化處理獲得的糖化液。在根據本發明上述方面的制 備乙醇的方法中，所述培養基可以含有對木素纖維素不使用稀酸進行蒸煮處理后、進行糖 化處理獲得的糖化液，且在所述糖化液中過度分解的糖類濃度是400ppm至1500ppm。根據 本發明的一個方面的連續培養裝置包括：培養槽，在所述培養槽中將具有木糖利用能力的 微生物在含有衍生自木素纖維素的糖類的培養基中連續培養；培養基供給部，其安置為將 額外培養基供給至培養槽，所述額外培養基含有衍生自木素纖維素的糖類；木糖濃度測定 部，其安置為測定培養槽中培養液的木糖濃度；和控制部，其安置為基于所述木糖濃度控制 供給。在根據本發明上述方面的連續培養裝置中，可以將控制部安置為控制供給，使得木糖 濃度調節至預先設定的閾值或以下。在根據本發明上述方面的連續培養裝置中，所述預先 設定的閾值可以是培養開始前的培養液中木糖濃度的1/3或以下。在根據本發明上述方面 的連續培養裝置中，所述預先設定的閾值可以是l〇g/L或以下。在根據本發明上述方面的 連續培養裝置中，可以將控制部安置為控制所述額外培養基向所述培養液的供給速度，使 得所述連續培養中每單位時間和單位液量產生的用于乙醇制備的微生物細胞數多于使用 所述培養基的分批培養中每單位時間和單位液量產生的用于乙醇制備的微生物細胞數。在 根據本發明上述方面的連續培養裝置中，所述供給速度可以大于自下述等式獲得的F :
[0015] F = VX (xnax-x〇)/xsXT/(tbatchX (T-t,))
[0016] 其中F表不所述額外培養基的供給速度，V表不所述培養液的液量，xmax表不使用 所述培養基的分批培養中的用于乙醇制備的最大微生物濃度，&表示使用所述培養基的分 批培養開始時的用于乙醇制備的微生物濃度，x s表示使用所述培養基的連續培養穩態時的 用于乙醇制備的微生物濃度，T表示在所述培養液中維持穩態的時間，t bateh表示使用所述 培養基的分批培養所需的總時間，和^表示在使用所述培養基的連續培養中，至建立穩態 時所需的總時間。在根據本發明上述方面的連續培養裝置中，可以對所述供給速度進行控 制，使得所述培養液中的木糖濃度是在使用所述培養基的分批培養結束時培養液中木糖濃 度的10倍或以下。在根據本發明上述方面的連續培養裝置中，所述培養基含有對木素纖維 素使用稀酸蒸煮處理后、進行糖化處理獲得的糖化液。在根據本發明上述方面的連續培養 裝置中，所述培養基可以含有對木素纖維素不使用稀酸進行蒸煮處理后、進行糖化處理獲 得的糖化液，且在所述糖化液中過度分解的糖類濃度是400ppm至1500ppm。
[0017] 在根據本發明方面的制備乙醇的方法和連續培養裝置中，基于培養液中的木糖濃 度控制額外培養基的添加。因此，能夠顯著提高使用具有木糖利用能力的微生物的乙醇生 產效率。
[0018] 附圖簡述
[0019] 下面引述附圖對本發明的示例性實施方案的特征、益處、以及技術和工業意義進 行描述，其中相同的數字表示相同的元件，和其中：
[0020] 圖1是顯示本發明的一個實施方案所用的一個連續培養裝置的例子的概略構造 圖；
[0021] 圖2是顯示本發明的實施方案所用的另一個連續培養裝置的例子的概略構造圖；
[0022] 圖3是顯示含有衍生自木素纖維素的糖類的培養基（糖化液）的添加速度與包括 乙醇濃度、木糖濃度和葡萄糖濃度在內的濃度之間關系的特性圖；和
[0023] 圖4是顯示過度分解的糖類濃度和乙醇生產率之間關系的特性圖。
[0024] 實施方案的詳細描述
[0025] 以下，引述附圖和實施例對本發明的一個實施方案進行更具體的描述。在根據本 發明實施方案的乙醇的制備方法中，在含有衍生自木素纖維素的糖類的培養基中連續培養 具有木糖利用能力的微生物，由此制備乙醇。特別地，在根據本發明實施方案的制備乙醇的 方法中，當連續添加含有衍生自木素纖維素的糖類的額外培養基時，基于培養液中的木糖 濃度確定所述額外培養基的添加控制，所述添加控制包括添加量的調節、添加速度的調節 和添加時機的調節。
[0026] 根據本發明實施方案的制備乙醇的方法能夠使用例如圖1中所示的連續培養裝 置1實現。
[0027] 連續培養裝置1包括：培養槽2,在其中將具有木