一種基因組dna序列精準編輯方法
【技術領域】：
[0001] 本發明涉及一種基因組DNA序列精準編輯方法。具體涉及聯合利用基因打靶技術 和傳統的同源重組技術，定點并無縫隙地插入或刪除基因組中特定的堿基序列的方法。
【背景技術】：
[0002] 在基因工程領域，研究人員們一直在試圖修飾基因組的堿基序列，以求失活某個 基因與獲得某個新基因的功能。
[0003] 大腸桿菌同源重組是20世紀90年代末發展起來的一種新的基因工程技術，可以不 必依賴限制性酶切位點，而定點精確地完成諸如片段插入、刪除及序列改變等等基因改造。 大腸桿菌同源重組技術常用于染色體DNA的靶向修飾-基因敲入與敲除，以及空隙修復 (gap-repair)方式獲取目的基因。原理是以PCR方法合成兩側50-70bp的短同源序列，然后 通過細菌內同源重組將短同源序列間的片段插入基因的目標位置或套取相應的基因目標 片段。申請人曾于1999年利用大腸桿菌同源重組技術成功敲除了細菌與鐵代謝有關的cyay 基因 （Li et al .Knock-out of the cyay gene in Escherichiacoli does not affect cellular iron content and seneitivity to oxidants.FEBS Letters 1999,456:13-6)〇
[0004] 但是，利用同源基因重組技術，突變率非常低，甚至不到萬分之一，僅適用于繁殖 較快單細胞生物，如細菌，可以利用某種抗菌素的活性進行大量篩選。
[0005] 基因打靶技術是另一種用于基因組定點改造的技術。近年來有較大發展，如2011 年，Daniel等（Daniel F , et al . Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic Acids Res 2011,39:6315-25)將TALE DNA結合motif與FokI核酸酶 融合，推出與（ZFNs)同類型的雙鏈DNA剪刀，稱之為TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)。2012年，Jinek等又報道一種更為簡單、高效和低成本的基因打革巴工 具--CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated)革巴向基因改造(敲除、敲入)技術(Jinek M，et al .A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 2012, 337(6096):816-21)。
[0006] 然而，基因打靶技術的發展僅僅局限于提高基因打靶效率，而不能提高基因打靶 的精準性以及突變的可控性。即，僅能將打靶的位點定位在某個基因的某個區域(通常為 數個或數十個堿基），而且，突變的內容是隨機發生，有時插入了一些堿基，有時缺失了一些 堿基，插入或缺失的堿基數目也不能隨意控制。無法滿足基因工程有時需要精準修飾某個 基因的需求。
[0007] 因此，對基因突變精準定點，并且對突變(刪除或插入）的內容實現完全任意可控， 對兩個等位基因進行同樣修飾或改造等DNA序列精準編輯技術的開發，非常有必要。
[0008] 目前尚未見到有關將同源基因重組技術和基因打靶技術結合，用于對基因組DNA 序列精準編輯。由于這兩種技術的原理完全不同，而且，依據現有DNA修復的理論知識，即使 二者聯合，僅能插入某特定序列，卻無法刪除某特定序列。
【發明內容】
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[0009] 本發明的目的是提供一種基因組DNA序列精準編輯技術，實現可精準定點、無縫隙 地插入或刪除特定的堿基序列。
[0010] 本發明聯合利用基因打祀技術(包括TALEN、CRISPR/Cas9等)和傳統的同源重組技 術實現了上述發明目的。
[0011] 所述TALEN或CRISPR/Cas9是本領域公認的普遍熟知的術語，TALEN或CRISPR/Cas9 是能夠特異性地分別與靶點的兩側或單側結合，從而導致靶點處DAN雙鏈斷開的質粒。其 中，TALEN是一對質粒，CRISPR/Cas9是單質粒。
[0012] 2011 年，Daniel等（Daniel F，et al.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic Acids Res 2011,39:6315-25)將TALE DNA結合motif與FokI核酸酶 融合，推出與鋅指酶同類型的雙鏈DNA剪刀，稱之為TALEN( Transcript ion Activator-Like Effector Nuclease)〇
[0013] 所述CRISPR/Cas9是2012年，Jinek等報道一種更為簡單、高效和低成本的基因打 革巴工具--CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ Cas9(CRISPR associated)革巴向基因改造（敲除、敲入）技術（Jinek M，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity·Science 2012，337(6096):816-21)〇
[0014] 如果僅根據現有技術的方法將同源基因重組和基因打靶技術兩種技術進行簡單 組合，將無法實現本發明的目的。
[0015] 這是因為，不僅兩種技術的原理完全不同，而且，依據現有DNA修復的理論知識，即 使聯合應用二者，也僅有可能實現插入某特定序列，并不能刪除某特定序列。
[0016] 本發明不是簡單的將傳統的同源重組與現代的基因打靶技術相結合，而是根據各 自的特征進行合理利用。首先TALEN或CRISPR/Cas9需要左右臂或gRNA序列與目的基因完全 結合才能發揮斷裂雙鏈DNA的效應，因此首先我們將TALEN的一條臂或CRISPR/Cas9的gRNA 設計在目標位點上（打靶位點在目標位點的上游或下游），將其轉染進細胞后就不會對 donor DNA進行切割，當得到單等位基因編輯的目的細胞后，我們又將打靶位點設計在目標 位點，這樣就避免TALEN或CRISPR/Cas9對已經編輯的一條鏈進行切割。此外在利用同源重 組的過程中，首先我們在打靶的同時轉入含有經過修飾過的donor DNA，使斷裂的DNA雙鏈 在修復的時候能與之進行同源重組，并最終得到經過校正的DNA鏈。后來，在得到一條單等 位基因修飾的鏈后，進行第二輪打靶時，便不再使用donor DNA，因為已經修飾的一條鏈即 是同源重組的最好模板。
[0017] 本發明人開創了一種基因組DNA序列精準編輯方法，按如下步驟進行：
[0018] 1)構建一個兩側由相關基因同源序列組成、其中含有該基因預期突變內容的 donor DNA；
[0019] 2)以預期突變位點附近為靶點設計相應的TALEN或CRISPR/Cas9;
[0020] 3)將該預先構造好的donor DNA與TELEN或CRISPR/Cas9同時轉染到操作細胞內； 實現TELEN或CRISPR/Cas9導致該基因靶點處雙鏈斷開，隨后，部分斷端會以donor DNA為模 板修復斷端，從而發生由TELEN或CRISPR/Cas9介導的基因同源重組；
[0021] 4)通過單細胞克隆培養與基因測序，篩選出相關基因發生預期突變的細胞株。
[0022] 上述步驟2)中，TALEN的其中一條臂或CRISPR/Cas9的gRNA應覆蓋插入特定序列的 位點或與欲刪除序列部分或完全重疊，使donor DNA模板上不存在相同的結合位點，從而避 免了 TALEN或CRISPR/Cas9破壞donor DNA。
[0023] 上述步驟4)完成后，如果發現兩個等位基因均發生了預期突變，基因組DNA序列精 準編輯即告成功;如果發現一個等位基因發生了符合預期的突變，而另一個等位基因仍處 于野生型態，可重復進行上述步驟3)和步驟4)操作，直到篩選出兩個等位基因均發生預期 突變的細胞株;如果發現一個等位基因發生了符合預期的突變，而另一個等位基因卻發生 了不符合預期的非特性突變發生時，則需要針對該突變的等位基因重新設計TELEN或 CRISPR/Cas9,這是因為這種非特異性突變可能改變了原來設計的TELEN或CRISPR/Cas9的 有效性。然后重復進行上述步驟3)和步驟4)操作，直到篩選出兩個等位基因均發生預期突 變的細胞株。
[0024] 本發明發生同源重組的機理：
[0025] 包括5個步驟：（1)產生雙鏈斷裂：目標部位的雙鏈DNA被FokI切斷；（2)入侵:兩個 5'到3'末端插入到打開的Donor DNA雙鏈，與相應的同源序列退火，其中至少有一個異源的 尾巴"漂浮在空中"；（3)修剪:這些"漂浮在空中"的異源尾巴被一些不明身份的DNA內切酶 切除；（4)SDSA(synthesis_dependent strand annealing，合成依賴鏈退火）：以Donor DNA 序列為模板進行邊合成邊退火；（5)Re-annealing:兩個新合成的DNA單鏈離開供體DNA模板 進行再退火，如果有必要還可能繼續以對方為模板進行SDSA，直到兩條鏈均完全修復。 [0026]本發明的以上方法已成功運用于⑶195基因的定點刪除改造。作為實施例，證明了 本方法的效果：
[0027]本發明實驗選擇了來源于人類膠質瘤的U87細胞株作為實驗的細胞模型，并通過 對其⑶195兩個等位基因的32個堿基進行了定點刪除改造，建立了基因型為⑶195 delta 32/delta 32的U87細胞株亞群，從而驗證了上述發明可行性、準確性與實用性。
[0028]本發明實驗中所操作的⑶195基因號為NG_012637.1，位于3號染色體1.31，所刪除 的32個堿