一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建、單抗及試劑盒的制備方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及免疫學測定分析領域，特別涉及一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建、單抗及試劑盒的制備方法。
【背景技術】
[0002]胃泌素釋放肽前體(ProGRP)是小細胞肺癌的一個非常可靠的指標，具有很好的靈敏度和特異性。肺癌早期無癥狀和癥狀輕微，2/3的患者在發現時已處于擴散階段，五年存活率小于5%，如能早期發現，通過手術治療，五年存活率高達70% — 80% ,ProGRP在小細胞肺癌早期就有可測濃度的分泌，所以該標志物毫無疑問能用于高危患者的篩查。
[0003]ProGRP的釋放不僅更多見于小細胞肺癌的癌細胞，而且還發現其在腫瘤和器官的特異性方面優于其他生物標志物。ProGRP具有強大的鑒別診斷能力是因為良性病變時ProGRP的產生量很少，其他癌癥(非小細胞癌癥和非神經內分泌癌癥)中也沒有ProGRP產生，或者產生量很少。ProGRP在預測復發及轉移可能性方面的表現要優于NSE，并能取代NSE對小細胞肺癌的治療進行監測。
[0004]但是，單純大腸表達的ProGRP免疫原是半抗原，免疫原性很差，后期嘗試過將重組表達的ProGRP化學偶聯大分子載體蛋白BSA或者KLH結構免疫活性也是很差。
[0005]人體正常狀態下少量表達HSP，其含量僅占總蛋白5%?10%，而且受自身免疫調節網絡作用，不會引起免疫應答反應。當病原體感染機體時，病原體相對抗體及其機體針對病原體均可合成HSP，二者HSP同源性高于50%，由此構成HSP在不同個體中介導抗感染免疫或自身免疫反應的基礎。
[0006]熱激蛋白融合表達蛋白是一種能增強所融合表達的蛋白免疫效果的一種表達方法，但這種方法存在篩選抗體時用到的抗原需要另外制備的問題，且往往需要額外的制備純的蛋白來進行抗體篩選;而未采用融合表達的方法制備出的抗體效價往往不高，需要很長時間才能篩選出較高效價的單抗。
【發明內容】
[0007]針對現有技術中的上述問題，本發明的目的是提供一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，能夠通過一次克隆表達，制備出高免疫原性的ProGRP和HSPA6融合蛋白，ProGRP-HSPA6融合蛋白既可以作為免疫原，也可以很方便的通過一步酶切制備出不含表達標簽的純ProGRP用于單抗鑒定及抗體篩選的蛋白抗原。
[0008]本發明的另一目的是提供一種利用上述胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體制備單抗的方法，利用ProGRP-HSPA6融合蛋白做為免疫原提高了免疫原性，增加了免疫效果，很大程度的提高了抗體制備和篩選效率。
[0009]本發明的另一目的是提供一種胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，試劑盒的制備周期短，所述試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中胃泌素釋放肽前體(ProGRP)水平，可以進行雙抗體夾心法的磁粒子化學發光檢測樣本。
[0010]為了達到上述目的，本發明采用如下技術方案:一種胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體的構建，包括如下步驟:
[0011 ] 在HSPA6蛋白基因上引入腸激酶酶切位點序列，通過酶切位點將帶腸激酶酶切位點的HSPA6克隆到載體上，得到中間表達載體;再通過酶切位點將ProGRP目的基因克隆到所述中間表達載體上，以構建得到ProGRP-HSPA6目的表達載體。
[0012]作為進一步的優選，通過BamHI/Notl雙酶切位點將帶腸激酶酶切位點的HSPA6克隆到載體上。
[0013]作為進一步的優選，通過Nadl/BamHI雙酶切位點將ProGRP目的基因克隆到所述中間表達載體上。
[0014]作為進一步的優選，所述中間表達載體為PET-28a_HSPA6表達載體，所述目的表達載體為PET-28a-ProGRP-HSPA6表達載體。
[0015]作為進一步的優選，根據uniprot蛋白數據庫的基因序列合成ProGRP基因片段。
[0016]利用上述胃泌素釋放肽前體蛋白表達載體制備單抗的方法，包括如下步驟:
[0017]I)將ProGRP_HSPA6表達載體導入宿主；
[0018]2)采用IPTG誘導表達融合蛋白；
[0019]3)鎳離子柱純化得高純度蛋白做為免疫原；
[0020]4)免疫動物；
[0021]5)取所述免疫動物的細胞制備融合細胞;篩選分泌單抗的雜交瘤細胞系，建立單抗細胞株，并制備單抗腹水。
[0022]作為進一步的優選，還包括步驟6)抗體的篩選:利用腸激酶切掉HSPA6+ProGRP融合蛋白的HSPA6標簽部分，得到純的ProGRP來篩選所述單克隆抗體。
[0023]作為進一步的優選，步驟2)中，將測序正確的重組體PET-28a-ProGRP-HSPA6轉入至BL21菌株中，經37°C培養至OD值達到0.55?1.0，在22°(:下以0.1_01/1 IPTG誘導2h，收集菌體，取少量的菌體制成SDS-PAGE樣品；將收集的菌體用PBS將菌株懸浮起來，加PMSF和DTT，然后加溶菌酶30min，期間要隨時調pH至8.0，最后加完Triton離心，去沉淀，取少量上清和沉淀制成SDS-PAGE樣品，進行SDS-PAGE分析。
[0024]作為進一步的優選，步驟3)中，將表達菌體重懸于60ml Bufer B(0.05mol/LNa3P04，0.3mol/L NaCl，0.0lmol/L imidazole ,pH 8.0)，進行超聲破碎細菌，然后離心取上清，上樣由Bufer B平衡過的N1-1DA親和層析柱，再用Buf er C(0.05mol/L Na3P04 ,
0.3mol/L NaCl，0.05mol/L imidazole，pH8.0)洗層析柱去除雜蛋白，最后通過Buffer D(0.05mol/L Na3P04，0.3mol/L NaCl，0.25mol/L imidazole,pH 8.0)洗脫，收集目的蛋白洗脫峰;SDS-PAGE檢驗蛋白純度，考馬斯亮藍染色結果用Quantity one進行灰度分析，估算目的蛋白純度;Western blot對蛋白進行鑒定。
[0025]作為進一步的優選，步驟4)中，免疫前先尾靜脈取血，作陰性對照。用ProGRP-HSPA6免疫6周齡BALB/C小鼠6只，背部皮下多點注射，免疫劑量為100只(即0.2mL/只);首次免疫，取無菌PBS溶解的ProGRP-HSPA6，與等體積的弗氏完全佐劑混合，漩渦混合儀上充分乳化;加強免疫，弗氏佐劑改用弗氏不完全佐劑，其余同前;共免5次，每次間隔2周，每次免疫后第10天斷尾采血，最后一次免疫后第10天眼眶采血，4°C過夜析出血清，3000r/min下離心lOmin，取上清，一部分直接于4°C冰箱內保存，一部分-20°C下保存備用，收集的抗血清用硫酸胺法進行純化。
[0026]作為進一步的優選，步驟5)中，蛋白純化產物免疫BAIB/c小鼠，取鼠脾臟與Sp2/0細胞混合;用ELISA方法篩選分泌單抗的雜交瘤細胞系，建立單抗細胞株，并制備單抗腹水。
[0027]作為進一步的優選，步驟6)中，純化的融合蛋白在50mMTris，pH值為8.5的緩沖液中透析過夜，置換緩沖體系為EK切割bufer(50mmol/L Tris-HCI，pH8.5)，按EK酶與蛋白1:1000的質量比加入EK酶，4°C低速搖床(60r/min)切割12h左右；切割后用Bufer B稀釋后鎳離子柱純化，分別收集穿透、10%B和100%B的蛋白，17.5%SDS-PAGE電泳進行鑒定;取穿透蛋白洗脫液，濃縮后包被于空白的酶標板上，用于抗體的ELISA效價鑒定;抗體效價測定:倍比稀釋單抗腹水，進行ELISA檢測，同時用Sp2/o細胞腹水作陰性對照。
[0028]—種胃泌素釋放肽化學發光試劑盒的制備方法，包括如下步驟:
[0029]吖啶酯標記一所述Pro-GRP單克隆抗體；
[°03°]將另一所述Pro-GRP單克隆抗體偶聯上磁粒子；
[0031 ]將樣本、磁粒子偶聯的Pro-GRP單克隆抗體及吖啶酯標記的Pro-GRP單克隆抗體進行反應后，形成抗體一抗原一抗體夾心復合體，制作成化學發光試劑盒用于樣本檢測。
[0032]作為進一步的優選，吖啶酯標記所述Pro-GRP單克隆抗體具體步驟如下:取一定量Pro-GRP單克隆抗體，采用0.05mol/L pH 9.5CB調整濃度為lmg/mL;按抗體:吖啶酯=I: 10?20摩爾比加入已活化吖啶酯，室溫反應0.5?1.0h;將反應液移至透析袋(截留分子量8000?12000)，采用0.05mol/L pH 9.5CB透析24h，加人等量甘油，放置?20°C以下保存。
[0033]作為進一步的優選，將所述抗體偶聯磁粒子具體步驟如下:將磁微粒或磁粒子用50mmol/L NaC03_NaHC03p