一種強表達活性的水稻非種子表達啟動子safes4及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和作物基因工程技術領域。具體而言，本發明涉及一種強表 達活性的水稻非種子表達啟動子及其應用，該啟動子能夠驅動目標基因在根、花、綠色組織 等非種子部位中特異表達，從而可在不影響種子的食用安全和繁殖活性情況下達到改良水 稻生產性能的目的。
【背景技術】
[0002] 轉基因就是以人為的方法改變物種的基因排列，通常涉及將某種生物的某個基因 從一連串的基因中分離，再植入另一種生物體內。水稻是世界上最重要的糧食作物之一。對 其遺傳特性、遺傳轉化以及育種利用等方面，科學家都進行了深入、細致的研究，也在世界 范圍內建立起了水稻遺傳轉化的技術平臺，可將優良目標外源基因導入特定的細胞而獲得 轉基因水稻植株，此后，許多目標基因都相繼成功地導入到水稻的不同組織中。
[0003] 與此同時，我們需要看到的是，轉基因水稻的商品化目前依然困難重重。其中一個 最主要的原因就是作為主食作物，人們對轉基因水稻的安全性存在較大顧慮，人們對此的 關注程度也日益提高。水稻轉基因帶來的安全性問題主要體現在生態環境安全和食品安全 兩大方面。具體而言，在生態環境安全方面，轉基因水稻對環境所帶來的問題主要是對栽培 稻、野生稻以及稻田雜草等非靶標生物可能帶來的潛在危險，比如，作物的生存競爭性、目 標基因的轉移、抗藥性的增強以及對非靶標生物的危害，進而破壞生態平衡。在食品安全方 面，由于稻米是我國乃至全世界最主要的食品來源之一，我國目前有一半以上的人口以稻 米為主食，人均攝入熱量的30%、蛋白質的19%均來源于稻米。隨著人民生活水平的提高， 稻米在糧食作物中的比重將持續增長。經過轉基因工程技術處理后的水稻及其加工產品是 否使人產生過敏反應、長期食用是否會患癌癥等致命性疾病，這都是需要關心的食品安全 問題。
[0004] 水稻作為主要的糧食之一，種子是食用部位和繁殖器官。在轉基因水稻中尤以外 源蛋白在胚乳中的積累及其可能造成的食用安全風險，成為制約商業化進程的重要因素。 利用組織特異性啟動子，驅動基因表達產物在特定器官或組織中積累，限定了目的基因的 作用范圍，避免了非必要組織中范式表達造成的物質能量浪費，降低或者避免在食用部位 積累的安全風險。研究非種子表達啟動子在轉基因水稻產業化的進程中最大限度地降低或 者避免其帶來的風險。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種驅動外源基因特異的在水稻根/花/綠色組織/非種子特 異表達的啟動子、獲得含有該啟動子序列的轉化子以及該啟動子的應用。
[0006] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供一種強表達活性的水稻非種子表達啟動 子SAFES4，其特征在于，所述強表達活性的水稻非種子表達啟動子SAFES4包含：
[0007] (a)SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列;或者
[0008] (b)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中取代一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0009] (C)在SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列中添加一個或多個核苷酸后所獲得的核 苷酸序列;或者
[0010] (d)SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列缺失一個或多個核苷酸后所獲得的核苷酸 序列;或者
[0011] (e)與SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。
[0012] 優選地，所述強表達活性的水稻非種子表達啟動子SAFES4由SEQ ID N〇:l所示的 DNA序列構成。
[0013] 另一方面，本發明提供一種表達盒，其特征在于，所述表達盒包含權利要求1所述 的強表達活性的水稻非種子表達啟動子SAFES4。
[0014] 另一方面，本發明提供一種重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體包含上 述的強表達活性的水稻非種子表達啟動子，在所述重組表達載體中，所述強表達活性的水 稻非種子表達啟動子連接SAFES4于載體中待表達的基因序列的上游。
[0015] 優選地，所述待表達的基因為Gus基因，所述重組表達載體為PCAMBIA1391-SAFES4，其中pCAMBIAl 391為作物雙元表達載體。
[0016]優選地，所述待表達基因是具有改善非種子性狀功能的基因。
[0017] 另一方面，本發明提供一種根據上述的強表達活性的水稻非種子表達啟動子 SAFES4在培育轉基因水稻中的應用，其特征在于，所述應用包括:將所述的強表達活性的水 稻非種子表達啟動子連接于載體中待表達的基因序列上游，從而構建重組表達載體;將所 述重組表達載體轉化到水稻細胞、組織或器官中進行培育。
[0018] 優選地，所述應用包括：
[0019] 利用序列表SEQ ID No.2和3中的引物，以水稻品種日本晴DNA為模板，擴增權利要 求1所述的水稻非胚乳表達啟動子SAFES4;
[0020] 回收目的片段，將其連接到PGEM-T-Easy載體上，按照熱激法轉化大腸桿菌XL-Blue感受態細胞后，使感受態細胞激活，進而將目的片段轉入到激活的感受態細胞中，然 后，經菌落PCR篩選獲得陽性克隆，挑取單克隆搖菌液提質粒，用引物進行雙酶切驗證，驗證 正確的克隆即為所要獲得的啟動子SAFES4;
[0021] 從上面獲得的陽性克隆中提取質粒，用引物雙酶切，回收啟動子SAFES4片段；
[0022]并利用SEQ ID No.2和3中所示引物對含有目標基因的載體進行線性化處理、回收 載體，將上述的SAFES4片段和載體片段用T4連接酶進行連接，得到啟動子SAFES4與目標基 因融合的作物表達載體，利用凍融法將作物表達載體轉入根癌農桿菌；
[0023] 利用農桿菌介導方法，對水稻種子，采用上面所獲得的轉入了重組表達載體的根 癌農桿菌進行農桿菌介導的遺傳轉化，獲得相應水稻植株。
[0024] 序列表中SEQ ID No : 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)的序列，本文中稱為SAFES4或啟動子SAFES4。具體而言，本申請的發明人發 現日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有轉錄活性的2022bp DNA序列 具有驅動目標基因在作物非種子組織特異表達的作用。并且分離克隆得到了序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列。
[0025] 需要說明的是，在所述重組表達載體中，該重組表達載體為將SEQ ID N〇:l所示的 序列即SAFES4或啟動子SAFES4構建于pCAMBIA1391中得到的重組表達載體，本文中稱為 PCAMBIA1391-SAFES4。
[0026] 如上面所提到的，待表達基因可以為任何對作物的非種子性狀具有改善能力的基 因。通過本發明的啟動子驅動該基因在非種子組織中特異性地集中表達，從而實現改善作 物非種子組織相應性狀及降低食用安全風險。
[0027]本發明中所提供的啟動子的DNA序列為(與序列表中SEQ ID N〇:l中相同）：
[0028] AGAGTGGAGAGAATTTGAACCGGTCAATCATAGACATTATTTCTACTCTTGCACTATATATTATTATTGCGAAGCTT AAATTGAGACATGGCGCATACTTATAGTGAATGCACAGTTTCTTTTTATTTGCTAAGCTTCCATATTGGCTGGACAT TTTTAATAAGTAATCCAAATGAAATCATTAGCTTGTAACAATCATGCCCTGTGCGGCTAATGAATTATCCAAAATGA TATGTTTCTGTACTTTTCCAGGTTCTATATATGACCCCATGTTTCCTAGATTTAGAATTGCCAGATTCTGTTGAATC AGAATTAAAATTTTTAGCTTATAGCAAGCATTTTCCATATGCTAATAACTTTCTTCCAATGAGATGTTTGGATCCTC TCCAACTATTATATATAATCACTTATTTTACTTTGTACAACAGACCATAAATGGCGATATATACTTGATGGAAGATA TGACAGTGCTCCCTGACATTGTGTTCTTGAACTTAATTTTCTTTTCAAGTGGATATTGTATTGGTCCTAGCTTATTC CATGTTCTCAGGATGACCACTGGTGTCAGAAGGTTGAAGCTAGAATTACATAATCATTATAAACGAGAGGTAAAAGC TGAAACTATACTTGGTTTGTTTATCTGATGCAGAGTTACTAAGGAAGTTACGAGAAGCAATTTGTATTTACATTTCC TGTCACACTAGGCTTGATTTGCTATTTTGCTACTTGCCCTACTCTATATAGTGGTTTGATACTGATATATGTAGTAA ATGTGTGACATATGCATCTCCTATCGGCAATACTTTGGGGCAACACAACAAGGATTTAGAAGATGATACTAACTGGC TATGCGTTATTGATATTAGAATACTTAGGACGTGCGTAAATTTATACTCCGTTTTCACAGAACTTTCTCATAGGACA G