一種茶樹miRNA及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物學技術領域，尤其涉及一種茶樹miRNA及其應用。
【背景技術】
[0002] 茶是世界三大飲料作物之一，富含豐富的代謝產物，對人體健康有重要作用。這些 代謝產物受植物體內氮素代謝的影響。氮代謝是植物體內重要的物質和能量代謝過程，其 中谷氨酰胺合成酶(GS;EC 6.3.1.2)是氮素代謝中的關鍵酶，其在ATP的供能下，催化NH4+合 成谷氨酰胺，然后在谷氨酸合酶的作用下將谷氨酰胺的酰胺轉化到酮戊二酸中，從而生成 兩分子的谷氨酸。GS/G0GAT是高等植物氮同化的主要途徑，目前在茶樹中已相繼克隆得到 谷氨酰胺合成酶的編碼基因 GS1;1基因，其可以受轉錄因子Dof，14-3-3蛋白的調控，從而參 與植物的氮素代謝過程。
[0003] microRNA(miRNA)是由18-25個核苷酸組成的非編碼RNA，首先由基因組轉錄，形成 帶帽狀結構和多聚腺苷酸尾巴的初級11^1?祖(？1'；[-11111?祖）。？1'；[-11111?嫩經核酸酶01'081^處理 后形成約70nt的含莖環結構的前體miRNA(pre-miRNA)，其后又經核酸酶剪切為成熟的 miRNA^iRNA通過堿基非完全配對與靶基因 mRNA3'utr序列結合，引導沉默復合體（1?財-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而調控基因表達。一個 miRNA可結合多個革E1基因，而一個mRNA也可由多個miRNA共同調節。這個復雜的調節網絡即 可通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某個基 因的表達。
[0004] 近年來，對于植物miRNA及其生物學功能的研究已成為熱點，研究對象主要集中在 模式植物擬南芥和水稻，玉米等模式作物中，而對于茶樹的miRNA序列信息被發現相對較 少，通過高通量測序及直接克隆獲得了部分miRNA，其功能的研究報道更為少見。公布號為 CN104830859A的專利文獻公開了一種茶樹miRNA及其應用，該茶樹miRNA的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。本發明通過Solexa高通量測序技術、生物信息學分析等技術，首次從茶樹浙 農139中鑒定了 miR156及其前體Cs-miR156g，并通過不同氮素處理驗證了不同氮素條件下 miR156的表達差異，得出兒茶素總量與miR156呈顯著負相關關系的結論，證明本發明茶樹 miRNA(miR156)及其前體Cs-miR156g在調控茶樹兒茶素表達中起到重要作用，茶樹miRNA (miR156)及其前體Cs-miR156g的表達可抑制茶樹中兒茶素的合成，在優質茶葉品種的培育 中具有潛在應用價值。
[0005] 因此，借鑒上述方法進一步發掘和鑒定茶樹中的miRNA，對其革E1基因進行鑒定，尤 其是調控茶樹氮素代謝的miRNA，從而在轉錄后水平調控茶樹的氮素代謝，提高茶樹的氮素 利用效率，改善茶葉的品質。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種茶樹特異miRNA及其應用，該miRNA能夠調控茶樹的氮素代謝， 可應用于提高茶樹氮素利用效率，改良茶葉的品質。
[0007] 一種茶樹miRNA，堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發明的茶樹miRNA是從茶樹浙農139品種幼苗的新梢中提取篩選得到，命名為 miR32,利用5'RLM-race技術鑒定茶樹miR32的靶基因 NCBI登錄號為AB115183,該靶基因為 茶樹谷氨酰胺合成酶的編碼基因 GS1; 1。谷氨酰胺合成酶是茶樹氮素代謝中的關鍵酶，因此 本發明鑒定出的茶樹miR32在茶樹氮素代謝中起重要作用。
[0009] 上述茶樹miRNA的前體，堿基序列如SEQ ID N0.2所示。
[0010] 轉錄形成上述茶樹miRNA前體的DNA片段，堿基序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011] 本發明通過生物信息學預測茶樹miR32的前體序列，PCR擴增，得到轉錄形成茶樹 miR32前體的DNA片段，測序得至IjDNA片段的核苷酸序列信息，進而分析出茶樹miRNA前體的 喊基序列。
[0012] 本發明將轉錄形成茶樹miR32前體的DNA片段插入了載體中得到重組質粒，有利于 茶樹miR32的穩定保存。可根據具體情況選用合適的載體，作為優選原始載體可為pCAMBIA 系列的植物表達載體，具體可選用PCAMBIA1301。
[0013] 本發明還提供了上述的茶樹miRNA在抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1表達中的應 用。
[0014] 本發明采用煙草瞬時表達技術證明茶樹miR32抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1的 表達，茶樹miR32作用于靶基因 mRNA的3'UTR序列。
[0015] 本發明提供了上述茶樹miRNA在調控茶樹氮素代謝中的應用。
[0016] 谷氨酰胺合成酶參與植物體內氮代謝的最主要途徑。miR32表達上調時，GS1;1表 達呈現下調。反之miR32表達下調時，GS1; 1表達呈現上調。因此通過miR32基因可控制GS1; 1 的表達，從而實現茶樹氮代謝調控。
[0017] 本發明提供了上述茶樹miRNA的前體在調控茶樹氮素代謝中的應用。
[0018] 本發明具備的有益效果：本發明通過Solexa高通量測序技術、生物信息學分析、 RT-PCR等技術，首次從茶樹浙農139品種中鑒定了 miR32及其前體。通過5'RLM-race、煙草瞬 時表達、實時熒光定量PCR等技術，證明miR32可以負調控茶樹GS1; 1基因表達。通過GS1; 1在 擬南芥中過表達驗證其在茶樹氮素代謝中的重要作用，表明miR32參與調控茶樹氮素代謝， 提高茶樹氮肥利用效率，改善茶葉品質如提高茶氨酸含量等方面具有潛在應用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖1為茶組植物miR32前體比對。
[0020] 圖2為miR32的前體結構。
[0021] 圖3為注射不同載體的煙草葉片GUS染色觀察，其中(A)單獨注射miR32;(B)單獨注 射空載PCMBIA1301; (C)單獨注射GS1; 1; (D)共注射miR32和GS1; 1。
[0022]圖4為miR32及GS1;1在缺氮處理下的表達分析，其中（A)缺氮2h，miR32表達情況； (B)缺氮48h，miR32表達情況；（C)缺氮2h，GSl; 1表達情況；（D)缺氮48h，GSl; 1表達情況。 [0023]圖5為在不同氮素處理下miR32及GS1;1的表達情況，其中（A)和(B)分別為芽葉和 根中miR32的表達分析，（C)和(D)分別為芽葉和根中GS1; 1的表達分析。
[0024]圖6為轉基因擬南芥在不同濃度銨條件下培養的形態觀察結果，其中A1和A2為對 照;B1和B2為4mM銨條件下生長情況;C1和C2為20mM銨條件下生長情況。
[0025] 圖7為轉基因擬南芥在不同濃度銨條件下的生物量測定結果，其中(A)為蓮座葉鮮 重；（B)為根鮮重；（C)為抽薹莖鮮重。
[0026] 圖8為轉基因擬南芥的生化指標測定結果，其中（A)為游離氨基酸含量測定結果； (B)為可溶性糖含量測定結果。
【具體實施方式】
[0027]下面結合具體實施例對本發明作進一步的闡述和說明，但本發明所保護范圍不限 于此。
[0028]下列實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規方法，所用的材料、試 劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑中獲得。
[0029] 實施例lmiR32的發掘和鑒定
[0030] 1.植物材料和樣品的準備
[0031] 取茶樹(Camellia sinensis)浙農139品種一年生扦插苗，置于人工氣候室中水 培，采摘茶樹幼苗的一芽二葉，液氮速凍后，-70 °C冰箱冷凍備用。
[0032] 2.茶樹miRNA的高通量測序
[0033] 采用Trizol法提取茶樹RNA
[0034] 1)取茶樹新梢100mg，迅速加液氮冷凍研磨至粉末狀；
[0035] 2)將粉末轉至1.5mL離心管內，加入1000ml Trizol試劑，冰上放置5min;
[0036] 3)加入200yL氯仿，蓋緊管蓋，用手用力搖晃試管15s，使其充分混勻，靜置5min后， 4°C 12000r/min離心 15min;
[0037] 4)小心吸取上層水相500yL轉入新的1.5mL離心管中，加入等體積異丙醇，上下輕 輕顛倒10次，室溫放置l〇min，4°C、12000r/min離心10min;
[0038] 5)小心倒掉上清，留取沉淀。加 lmL75%乙醇振蕩洗滌兩次，4°C、7500r/min離心 5min；
[0039] 6)倒去乙醇，將離心管放置超凈臺開風機吹干，注意不能讓RNA沉淀完全干燥，后 加入30yL ddH20溶解沉淀；
[0040] 7)將獲得的RNA樣品