轉基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁側序列及其應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬植物生物技術領域，具體地，涉及一種抗病轉基因大豆事件B4J8049外源 插入片段旁側序列以及用于檢測該序列的PCR引物，本發明還涉及利用該引物對轉基因大 豆事件B4J8049進行特異性檢測的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002]大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot, PRR)是由大豆疫霉菌（Phytophthora so jae)引起的一類土傳檢疫性病害。該病原菌在大豆整個生育期都能侵染大豆并造成危 害，導致早期大豆爛種、猝倒和中后期根、莖腐爛。大豆疫霉根腐病在全球各大豆主產區均 有發生，每年造成大豆產量損失超過10億美元，是危害大豆生產的毀滅性病害之一。我國自 1989年首次在東北地區分離到該病原菌以來，隨著國外大豆品種的不斷引入，大豆疫霉根 腐病在我國大豆主要產區特別是東北大豆主產區的發生和為害程度逐步加重。一般發病率 在5%左右，感病品種一般減產25 %-50%，高感品種可達90%以上。嚴重地塊的大豆植株成片 枯死，甚至絕產，對我國大豆生產構成巨大的潛在威脅。
[0003]大豆疫霉菌為寄主專化性病原菌，屬鞭毛菌亞門卵菌綱疫霉屬。該病原菌生理小 種分化明顯，自1965年首次報道1號、2號生理小種以來，目前已報道的大豆疫霉菌生理小種 至少有55種以上(Leiz RA等，2000)，且不同地區的生理小種分布不同。朱正東和馬淑梅等 (2005)對我國東北地區大豆疫霉菌生理小種分布情況鑒定表明，該地區疫霉菌生理小種組 成多樣化，包括1號、3號、4號、13號、15號等，其中1號生理小種為優勢種群，占鑒定小種數量 的60%以上。目前生產上對大豆疫霉菌的防治主要采用種植抗病品種，改進栽培措施和化學 防治等方法。由于大豆疫霉根腐病為土傳病害，采用化學防治較為困難，且常用的化學殺菌 劑如甲霜靈等并不是對所有生理小種都有效。輪作等栽培措施雖然可以在一定程度上減緩 病原菌的危害，但并不能夠完全控制病害，且在大豆實際生產中應用具有一定的局限性。抗 病品種的培育和種植是防治大豆疫霉根腐病最為經濟、有效和環境安全的措施。
[0004]目前在大豆資源中發現了多個對疫霉根腐病存在小種特異性抗性的大豆品種，攜 帶 1個或多個抗性基因如Rpsla、Rpslb、Rpsld、Rpslk、Rps3a、Rps3b、Rps3c、Rps4、Rps5、 Rps6、Rps7、Rps8等。由單一抗性基因 Rps介導的抗性，在受到病原菌侵染后，通常會引發寄 主產生超敏感反應(hypersensitive response，HR)，從而對病原產生較強的抗性。但由于 單基因控制的抗性極易造成病原生理小種的快速分化，導致新的病原小種產生并對原有抗 病品種產生抗性。由于抗源基礎狹窄，病原生理小種毒性類型復雜，而且變化很快，新的小 種不斷出現，利用常規育種方法育成的大豆疫霉根腐病抗病品種的平均使用壽命很短，易 出現抗性退化等方面問題。因此，如何進一步拓寬大豆霉根腐病抗源基礎，提高大豆抗疫霉 根腐病水平及抗性持久性，延緩病原生理小種的進化速度，對于減少大豆病害的發生，提高 大豆產量和保護環境等方面均具有重要的意義。
[0005]目前國際上利用轉基因技術提高大豆疫霉根腐病抗性的研究較少。Sumit R.等 (2012)報道利用擬南芥非宿主抗性基因 pssl轉化大豆品種，轉基因大豆對疫霉根腐病的抗 性顯著提高。Fan S等(2015年)研究表明，編碼抗菌活性蛋白基因 Gly m 41在大豆中的過量 表達可以顯著增強轉基因大豆抗疫霉根腐病能力。國內郭玉雙等(2006)在大豆中過表達菜 豆幾丁質酶基因 chi和大豆核糖體失活蛋白基因 rip，獲得抗性水平較受體品種明顯提高的 轉基因大豆株系。我們采用轉基因技術，將我國自主克隆的廣譜抗病基因 hrpZPsta按照大豆 偏愛性密碼子進行人工優化，并導入栽培大豆基因組，獲得了一個對疫霉根腐病抗性水平 顯著提高的轉基因大豆事件B4J8049。該轉基因大豆事件已進入環境釋放，今后有可能進入 商業化種植。對轉基因事件進行特異性檢測，能更好的對轉基因植物進行監督管理，而外源 插入片段的旁側序列和根據此旁側序列建立的檢測方法，是對轉基因植物及其產品進行有 效監督管理的一個重要依據。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種抗病轉基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁側序列 以及用于檢測該序列的PCR引物。
[0007] 本發明的另一目的在于提供一種轉基因大豆事件的特異性PCR檢測方法和試劑 盒。
[0008] 本發明提供的抗病轉基因大豆事件B4J8049按如下方式獲得： 根據大豆密碼子偏愛性對hrpZPstaS因序列進行人工優化，新序列命名為hrpZm，序列 如SEQ-2所示。優化序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并連接到克隆載體pUC-57 上，構建載體pUC57-hrpZm。分別用Pstl/Xbal雙酶切pUC57-Gmubi3和中間載體pTF101-35S， 膠回收Gmubi3酶切片段和pTF101-35S酶切大片段，并利用T4 DNA連接酶連接，構建中間表 達載體pTF101-Gmubi3。采用同樣的方法，利用Xbal/SacI雙酶切pUC57-hrpZm質粒和中間載 體pTF101-Gmubi3,回收hrpZm酶切片段和pTF101-Gmubi3酶切大片段，構建植物表達載體 pTF101-Gmubi3_hrpZm。載體中目的基因 hrpZm位于大豆組成型強啟動子Gmubi3下游，終止 子為nos。構建載體結構如圖1所示。
[0009] 采用凍融法將pTF101-Gmubi3-hrpZm質粒轉入農桿菌EHA101。利用浸泡24小時的 大豆種子作為外植體。沿大豆種臍部位將大豆種子剖開，并在子葉節位置輕微劃傷處理后， 用攜帶載體質粒的農桿菌進行侵染。共培養4天后，在含6m g//L草丁膦的誘導培養基上進行 連續3輪篩選培養。篩選獲得的抗性芽經誘導伸長和生根后再生為完整的小植株。再生苗移 栽至溫室中開花、結實。經連續多代PCR檢測和田間除草劑(BASTA)噴施篩選，獲得轉基因大 豆事件B4J8049。
[0010] 采用Southern雜交檢測及轉基因后代外源片段分離比例分析，確定該轉基因事件 外源片段為單拷貝插入。Southern雜交檢測結果如圖2所示。連續多代接種疫霉菌結果表 明，轉基因事件B4J8049對大豆疫霉根腐病具有較好的抗性。
[0011]本發明提供了抗病轉基因大豆事件B4J8049外源插入片段右邊界旁側序列， 其具有SEQ-1所示的序列或其特異性片段或互補于該序列的序列。
[0012] 本發明提供了 SEQ-1所示序列在檢測抗病轉基因大豆事件B4J8049包括親本、衍生 品系或品種，及其制品包括植株、組織、種子及產品中的應用。
[0013] 鑒于獨立轉基因事件中，外源T-DNA片段在植物基因組中的整合具有隨機性的特 點，不同轉基因事件其外源片段在基因組中的插入位點不同。對于特定的轉基因事件來說， 其旁側序列是特異的。因此，應用插入片段旁側序列可以對轉基因事件進行特異性檢測。如 利用包含部分旁側序列和部分外源插入片段序列的探針進行雜交，或是設計包含部分旁側 序列和部分外源插入片段序列的特異性引物進行PCR擴增等。可以根據5'端旁側序列設計 上游引物，外源插入片段序列設計下游引物，擴增特異性片段;或是根據外源插入片段序列 設計上游引物，3'端旁側序列設計下游引物，擴增特異性片段。
[00M]本發明還提供了用于擴增SEQ-1所示序列的特異性引物。
[0015] 在本發明提供的一個實施例中，提取轉基因大豆事件B4J8049葉片基因組DNA，利 用特異性引物和高簡并性隨機引物進行TAIL-PCR擴增，獲得外源片段在轉基因大豆基因組 中整合位點的右邊界l〇27bp序列。包括第1 一993bp大小為993bp的大豆基因組序列和第 994一 1027bp大小為34bp的外源片段序列，如SEQ-1所示序列。分析外源片段整合位點的右 邊界序列，根據插入片段右邊界左側序列(T-DNA區內）設計特異性上游引物財北049? :5'_ TTTCCCGCCTTCAG TTTAAACTATCAG-3 '（ SEQ-5);根據大豆基因組序列設計特異性下游引物 B4J8049R: 5'-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3'（SEQ-6)。利用PCR反應進行擴增，獲得 1010bp 特異性片段，包括第1 一976bp大小為976bp的大豆基因組序列和第977-1010bp大小為34bp 的外源片段序列（SEQ-7)。
[0016] 本發明提供了上述引物在制備檢測轉基因大豆試劑盒中的應用。
[0017] 本發明提供了一種檢測轉基因大豆事件B4J8049的方法，以大豆樣品總DNA為模 板，利用本發明提供的引物進行PCR反應，根據PCR產物的電泳片段判斷結果。
[0018] 上述檢測轉基因大豆事件B4J8049的方法，其PCR反應體系（25uL)為：10 X PCR緩沖 液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL, 5U/uL Taq酶0.5uL，大豆樣品總DNA 1.0uL，10umol/L上 游引物0.5 uL，10umol/L下游引物0.5 uL，ddH20 19.5 uL〇
[0019] PCR反應條件為：95°