一種嗜熱β-葡萄糖苷酶突變體-M36N及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，具體地，本發明涉及一種嗜熱β-葡萄糖苷 酶突變體Μ36Ν及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002] 當今，以木質纖維素為原料、用纖維素酶水解纖維素生成葡萄糖，進而發酵為燃料 乙醇成為應對當今世界能源危機、環境污染等問題的重要出路。纖維素的降解是三類酶協 同作用的結果，包括：內切纖維素酶(end〇-l，4-0-D_glucanase，EC 3.2.1.4,簡稱EG)，這類 酶首先作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機水解β-1，4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子切 割產生大量帶非還原性末端的小分子纖維素；外切纖維素酶(exo-1，4-0-D_glucanase或 cellobiohydrolase，EC3.2.1.91，簡稱CBH)，這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β_1， 4糖苷鍵，每次降解產生一個纖維二糖分子;β-葡糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21， 簡稱BG)，這類酶作用于纖維二糖或纖維寡糖的非還原端，產生葡萄糖分子。其中BG通常不 直接作用于纖維素，但是它可以降解對纖維素降解起抑制作用的纖維二糖，所以它是快速 降解纖維素過程中所必須的酶類。因此對葡萄糖苷酶的深入研究受到人們越來越多的關 注，特別是β-葡萄糖苷酶的分子改良研究。
[0003] 本發明針對酶分子具體結構進行分析和改良，以達到提高催化效率的目的。本發 明所提供的高溫酸性葡萄糖苷酶突變體對于纖維二糖底物的催化效率得到了極大地提 尚。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供了一種高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體Μ36Ν。
[0005] 本發明的再一目的是提供編碼上述高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體Μ36Ν的基因。
[0006] 本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。
[0007] 本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0008] 本發明以來源于嗜熱真菌籃狀菌Talaromyces leycettanus JCM12802的酸性β-葡萄糖苷酶為母本，采用分子生物學技術對酸性葡萄糖苷酶序列進行區域替換后表達。 [0009]根據本發明的高催化效率β_葡萄糖苷酶突變體，是β_葡萄糖苷酶的催化活性通道 loop區域替換后得到的突變體，即β-葡萄糖苷酶的36位氨基酸由甲硫氨酸"Μ"突變為天冬 酰胺"Ν"
[0010]所述高催化效率葡萄糖苷酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] YGFGGSGWDAAYGRAKAALNKLNQTEKVGIVTGVKWNGGPCVGNTYKPSSIDYPSLCLQDSPLGVRFANPVTAFPAG INAGATWDRSLINARGAAMGAEAKGLGVNVQLGPVAGPLGKNPNSGRIWEGFSNDPYLSGVAMEETIAGMQGSGVQA CAKHYIGNEQEHNRETISSNIDDRTLHELYVWPFMNAVKANVASVMCSYNEVNGSWSCENDALLNGLLKTELGFPGY IMSDWNAQHTTVNSANSGLDMTMPGSDFNNPPGSIYWGPNLEAAVANGSVPQSRLDDMVTRILASWYLVGQDEGYPP VAFSSWNGGKANVDVTCDHKSWRAVARDSIVLLKNDNNALPLRKPKSLAIIGQDATVNPAGPNACSDRGCDTGTLA MGWGSGTAQFPYIVGPLDAIQSQAAADGTNITTSTTDDTTAAASAAASAGTAIVFINSDSGEGYITVEGNAGDRNNL DPWHNGNELVQAVAAVNKNVIVVVHSVGPVILEAILAQPNVKAIVWPGLPGQESGNALVDVLYGSTSPSGKLPYTIA KQFSDYGTTWTTSLVDDFTEGLFIDYRHFDENNITPRYEFGYGLSYTTFKYSDLDVNVQARPGAAEGPIVPGGVKEL FDTVGTVTVTVQNSGKVAGAEVAQLYIGLPDSAPSTPPKQLRGFQKLHLAPGQREGATFELTRRDISYWDVQQQKWV VPSGTFKVYVGSSSRDIREQGSFRI
[0012] 所述高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0013] TATGGCTTCGGCGGCTCTGGCTGGGACGCCGCTTATGGCAGAGCAAAGGCTGCGCTGAACAAGCTCAACCAGACCGA GAAGGTTGGTATCGTCACCGGTGTCAAGTGGAACGGCGGCCCTTGTGTTGGCAACACCTACAAGCCCAGTTCGATTG ACTACCCTTCTCTGTGTTTGCAAGACTCTCCTCTCGGGGTGCGTTTTGCCAACCCTGTGACTGCCTTCCCGGCTGGT ATCAACGCCGGCGCCACATGGGATAGATCTCTCATCAACGCCCGTGGTGCGGCCATGGGCGCTGAGGCCAAGGGCCT CGGTGTGAACGTCCAGCTTGGCCCCGTCGCTGGTCCTCTCGGCAAGAATCCCAATAGTGGCAGAATCTGGGAAGGGT TCTCGAATGATCCCTATCTCAGCGGTGTTGCGATGGAGGAAACCATCGCCGGAATGCAAGGATCTGGTGTGCAGGCC TGCGCCAAGCACTATATTGGTAACGAGCAAGAGCACAACCGTGAAACCATCAGCTCCAACATCGATGACCGCACTCT GCACGAGCTCTACGTCTGGCCGTTCATGAACGCCGTCAAGGCCAACGTCGCCTCCGTCATGTGCTCGTACAACGAGG TCAATGGTTCCTGGTCCTGTGAGAATGATGCTCTTCTCAACGGTCTGTTGAAGACTGAGCTCGGATTCCCCGGATAC ATCATGAGCGATTGGAACGCGCAGCACACCACGGTCAACAGCGCCAACTCGGGTCTCGATATGACCATGCCTGGCAG TGACTTCAACAACCCTCCTGGCAGCATCTACTGGGGGCCCAACCTCGAAGCCGCCGTCGCCAATGGCTCCGTTCCGC AGTCCCGTTTGGACGACATGGTCACTCGTATCCTTGCGTCTTGGTACTTGGTTGGCCAGGATGAGGGCTACCCACCG GTCGCCTTCAGCTCCTGGAATGGCGGCAAGGCCAATGTTGACGTGACGGGCGATCACAAGAGCGTCGTCAGAGCTGT GGCTCGTGACTCTATCGTTCTTCTGAAGAACGACAATAACGCTTTGCCTCTGCGCAAGCCCAAGAGCCTCGCGATCA TCGGCCAGGATGCAACTGTCAACCCTGCCGGGCCCAACGCTTGCTCTGATCGCGGCTGCGACACCGGTACTCTCGCC ATGGGTTGGGGCAGTGGTACCGCTCAGTTCCCATACATCGTCGGCCCTCTCGATGCTATCCAGTCTCAGGCTGCCGC TGATGGCACTAACATCACCACCAGCACGACCGATGATACCACCGCGGCAGCTTCTGCAGCCGCCTCCGCCGGAACCG CCATCGTCTTCATCAACTCCGACTCTGGTGAAGGTTACATCACCGTCGAGGGCAACGCTGGTGACCGCAACAACCTC GACCCCTGGCACAACGGCAACGAGCTCGTCCAGGCCGTTGCGGCTGTGAACAAGAATGTCATTGTCGTTGTCCACAG CGTCGGTCCCGTGATCTTGGAGGCTATCCTTGCACAGCCCAACGTCAAGGCCATTGTGTGGCCCGGTCTCCCTGGAC AAGAGAGCGGCAATGCCCTGGTCGATGTTCTGTACGGCTCCACCTCCCCCAGCGGCAAGTTGCCCTATACCATTGCC AAGCAGTTCAGCGACTATGGCACCACCTGGACGACCTCCCTGGTCGATGACTTCACCGAGGGTCTGTTCATTGACTA CCGCCACTTTGACGAGAACAACATTACTCCCAGATACGAGTTCGGATACGGCTTGTCTTACACCACCTTCAAATACT CCGACCTGGACGTCAACGTCCAGGCCCGCCCCGGCGCAGCCGAAGGCCCCATCGTCCCCGGCGGCGTCAAGGAACTT TTCGACACCGTCGGCACCGTCACCGTCACCGTCCAGAACAGCGGCAAGGTTGCCGGCGCGGAAGTTGCCCAGCTGTA CATCGGCCTTCCCGACTCTGCCCCGTCGACCCCTCCCAAGCAGCTCAGAGGATTCCAGAAGTTGCACCTCGCGCCCG GCCAGAGAGAGGGCGCCACTTTCGAACTCACCCGCCGAGACATCAGCTACTGGGACGTTCAGCAGCAGAAGTGGGTT GTTCCTAGCGGTACGTTCAAGGTCTATGTTGGAAGCTCGAGCAGGGACATTAGGGAGCAGGAATCTTTCCGTATTTG A
[0014] 本發明還是提供一種制備高催化效率β-葡萄糖苷酶的方法：
[0015] 1)采用over-lap PCR的方法擴增高催化效率β-葡萄糖苷酶突變體基因序列；
[0016] 2)將催化效率β-葡萄糖苷酶突變體序列片段克隆到表達載體pPIC 9r上，重組載 體命名 pPIC9r-A-M36N;
[0017] 3)將突變體重組載體轉化畢赤酵母GS115，誘導表達，獲得突變株，優選為GS115/ A-M36N。
[0018] 本發明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶突變體基因的重組載體，優選為pPIC9r-A-M36N。將本發明的β-葡萄糖苷酶突變體基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之 間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方 案，優選為將葡萄糖苷酶基因插入到質粒pPIC9r上的EcoR I和Not I限制性酶切位點之 間，得到重組表達質粒pPIC9r-A-M36N。
[0019] 本發明還提供了包含上述β-葡萄糖苷酶基因的重組菌株，優選為重組菌株GS115/ Α-Μ36Ν。