一種酮還原酶及其在不對稱合成手性羥基化合物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種酮還原酶，該酮還原酶的制備方法， 以及該酮還原酶作為催化劑在不對稱合成手性羥基化合物中的應用。
【背景技術】
[0002] (R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯（(R)-HPBE，CAS 號：90315-82-5)是一種手性仲醇， 它是合成眾多血管緊張素轉化酶（ACE)抑制劑（即普利類藥物）的關鍵手性砌塊。
[0003]
[0004] 普利類藥物主要用于治療心力衰竭、高血壓。目前在中國抗高血壓藥物市場上主 要有ACE抑制劑、鈣拮抗劑、血管緊張素 II受體拮抗劑和β -受體阻滯劑四類抗高血壓藥 物。普利類藥物近年受到沙坦類藥物的影響，銷量有所下降，但由于受到歐盟新標準和國內 一些廠家退出的影響，價格較為穩定。
[0005] 自1977年Ondetti等研究開發了第一代的卡托普利后，普利類藥物已經拓展到80 多個衍生物，常見的幾種普利藥物如上所示。普利類藥物由于具有療效顯著、不良反應小、 作用時間長等優點，在臨床上仍有廣泛的應用前景。由于（R)-HPBE是該藥物的關鍵手性中 間體，對于（R)-HPBE合成新方法的研究仍具有較大的實用意義和工業應用前景。
[0006] 合成（R)-HPBE的方法包括化學法和生物法。其中，化學法是由價廉易得的原料 出發，經過多步反應最終合成（R)-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸經過多步反應生成2-羥 基-4-苯基丁酸，再經過去消旋化和酯化作用合成（R)-HPBE ;再如由乙二酸二乙酯和苯丙 酸乙酯作為起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后經過不對稱氫化得到（R)-HPBE。化 學法在產物規模上具有較為明顯的優勢，可達到500公斤的生產規模，但是，化學法要用到 重金屬Pt等污染環境的催化劑，無法滿足綠色化學的要求且成本較高。另外，化學法存在 收率較低、反應條件較為苛刻、對底物的純度要求高、得到的產物的光學活性較低等缺點， 所以不適合進行規模化生產的進行。
[0007] 目前生物法合成（R) -HPBE主要有兩種途徑，一種是利用脂肪酶來拆分rac-HPBE 得到（R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后經過乙酯化得到（R)-HPBE。另一種途徑是用酮還原酶 0ΡΒΕ或0ΡΒΑ進行不對稱還原，生成（R) -HPBE或（R) -HPBA，（R) -HPBA可經過進一步酯化合 成（R)-HPBE。利用酮還原酶進行不對稱還原，理論得率可以達到100%，而脂肪酶的理論得 率最高只能達到50%，酮還原酶具有一定的優勢，但酮還原酶催化反應通常需要額外添加 價格昂貴的輔酶NAD +/NADP+。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題是，針對已報道的不對稱還原反應制備（R)-HPBE反 應中收率較低、反應條件較為苛刻、對底物的純度要求高、得到的產物的光學活性較低、或 者需要添加價格昂貴的輔酶等問題，提供了一種催化活性高、對映選擇性強、底物耐受性 好的酮還原酶，以及使用該酮還原酶催化合成（R)-HPBE，進而進一步合成普利類藥物的 酶-化學合成方法。還提供了編碼該酮還原酶的核酸序列，含有該核酸序列的重組表達載 體、重組表達轉化體及該酮還原酶的制備方法，以及該酮還原酶在催化羰基底物不對稱還 原中的用途。
[0009] 本發明通過下述技術方案以解決上述技術問題：
[0010] 本發明的第一方面提供了一種酮還原酶，其是如下（a)、（b)或（c)的蛋白質：
[0011] (a)由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的蛋白質。
[0012] SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質由環境DNA編碼，具有酮還原酶的功 能，是一種新的酮還原酶。
[0013] (b)在（a)的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸殘基衍生的 具有酮還原酶活性的蛋白質。
[0014] 其中，所述的"幾個"是指2個至100個，更佳地小于30個，最佳地小于10個。比 如添加一個外分泌信號肽的融合蛋白。根據本發明，在如SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋 白質分子中進行1~5個氨基酸殘基的突變，仍然保持酮還原酶活性。也就是說，只要由（a) 衍生的蛋白質具有酮還原酶活性，且衍生方式如上所述，都可以達到本發明的發明目的。
[0015] (c)與（a)的氨基酸序列具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性且具有酮還原酶活性的蛋白質。
[0016] SEQ ID N0:2所示的酮還原酶和其他已知酮還原酶的氨基酸序列的同一性低于 90%，具有顯著差異性，例如與嗎啡脫氫酶YtbE之間的同一性為85%。
[0017] 在本文中，氨基酸序列之間的同一性是根據序列的全長進行計算，優選采用NCBI Blastp程序進行比對，默認參數。
[0018] 本發明的第二個方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發明的酮還原酶。優選地， 所述核酸是由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列組成的。
[0019] 由SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列組成的核酸來源于環境DNA，其可以從土壤樣本 中分離獲得，也可以從含有該核酸的重組表達載體中或重組轉化體中分離獲得，也可以全 基因人工合成獲得。
[0020] 本發明中，SEQ ID N0:1所示的基因命名為BYK-KRED，全長843bp。其中，其編碼 序列（CDS)從第1個堿基起至第840個堿基止，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。該 序列無內含子，其編碼的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
[0021] 如本領域技術人員所知，由于密碼子的簡并性，編碼SEQ ID N0:2的氨基酸序列的 核酸序列不僅僅局限于SEQ ID N0:1。本發明的酮還原酶基因的核酸序列也可以是編碼序 列表中SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，還可以通過適當引入替 換、缺失或插入來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以通過 對核酸序列SEQ ID NO: 1的一個或多個堿基在保持酶活性范圍內進行替換、缺失或添加來 制得。
[0022] SEQ ID NO: 1的同系物也指啟動子變體。在所述的核酸序列之前的啟動子或信號 序列可通過一個或多個核酸的替換、插入或缺失而改變，但這些改變對啟動子的功能沒有 負面影響。而且通過改變啟動子的序列或甚至用來自不同種生物體的更有效的啟動子完全 替換，可提商目標蛋白的表達水平。
[0023] SEQ ID NO: 1的同系物還指在標準條件下能夠與SEQ ID NO: 1所示序列的核酸 進行雜交的核酸序列。在標準條件下進行雜交可根據《分子克隆實驗指南》中描述的方 式進行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物學中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)。具體來說，雜交可以按照如下步驟進行：將一個 載有被轉錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交；雜 交緩沖液的組成為〇. lwt % SDS、5wt %硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀釋抑制劑以及2~ 8 X SSC (20 X SSC為3M氯化鈉和0. 3M的檸檬酸組成的溶液）；雜交溫度為50~70°C;在培 養幾個小時或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜；清洗溫度為室溫，更優選為雜交溫度；清洗緩 沖液的組成為6XSSC+0. lwt% SDS溶液，更優選為5XSSC+0. lwt% SDS ;當用這種清洗緩 沖液清洗完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA 分子。
[0024] 本發明的第三個方面提供了一種包含本發明的編碼酮還原酶的核酸序列的重組 表達載體。其可通過本領域常規方法將本發明所述的編碼酮還原酶或其突變體的核酸序列 連接于各種表達載體上構建而成。所述的表達載體可為本領域常規的各種載體，如市售的 質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體等，優選pET系列質粒。較佳地，可通過下述方法制得本發明 的重組表達載體：將通過PCR擴增所得的目的核酸片段與表達載體pET21a分別用限制性內 切酶Nde I和Hindlll雙酶切，形成互補的粘性末端，經T4DNA連接酶連接，形成含有本發 明的編碼酮還原酶的核酸序列的重組表達質粒pET21a-BYK-KRED或含有編碼其突變體的 核酸序列的重組表達質粒。
[0025] 本發明的第四個方面提供了一種包含本發明的重組表達載體的重組表達轉化體。