一種用于nk細胞體外擴增的培養基及nk細胞體外擴增的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及免疫學領域，具體涉及一種用于NK細胞體外擴增的培養基及NK細胞體 外擴增的方法。
【背景技術】
[0002] 自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，在抗腫瘤和抗 病毒感染免疫中起著重要作用。由于NK細胞殺傷活性無 MHC限值，因此稱為自然殺傷細胞。 NK細胞的靶細胞主要是腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞（如血細胞)及寄生蟲 等，因此NK細胞是機體抗腫瘤、抗感染免疫的重要組成部分。由于這些特點，NK細胞在細胞 免疫治療上有著廣泛的應用前景。在體外被活化的NK細胞毒性較高，可用作免疫細胞的治 療制劑。人體體外及動物試驗證實了其對各種癌癥治療的可能性:利用腫瘤細胞系的方法， 確認其對血液系統腫瘤（白血病和淋巴瘤等）、肝癌、肺癌、腎癌、神經系統腫瘤和皮膚癌等 均具有體外細胞毒性，特別是對白血病和神經源性腫瘤已明確了其臨床及非臨床的治療效 果。2009年，NK細胞治療技術就已列入國家三類醫療技術目錄。
[0003] 充足的細胞數量和強烈的細胞毒性是細胞治療療效提升的關鍵因素。由于人外周 血中NK細胞含量很少(約占淋巴細胞的5~10%)，從外周血中分離NK細胞成本昂貴，而且分 離的NK細胞一般都處于非活化狀態，在很大程度上限制了其在臨床上應用。要達到治療效 果，所需的有效NK細胞數量單一批次應用至少要5 X109個(且純度達到80%以上），目前有 報道的采用無血清培養體系，通過IL-2、IL-21及相關組合因子刺激培養均不能實現NK細胞 的高活性、高純度和高擴增倍數，其擴增能力最多達到300倍，臨床應用存在安全風險。通過 自體血清培養體系實現規模擴增，且獲得單一培養體系、單批次擴增的細胞數量大于IX 101()個疆細胞，且純度大于90%的未見報道。
[0004] CN 102586185 A公開了一種K562細胞擴增激活NK細胞的方法，具體為使用跨膜 IL-21，CD14，CD19，CD86和CD137轉染的K562細胞和低濃度白介素2共同作用定向擴增激活 自然殺傷細胞的方法，該發明是以K562細胞系轉錄穩定表達⑶8α-白介素21、CD14、⑶19、 ⑶86和⑶137的表達載體，⑶8α為在細胞膜上表達的膜蛋白，⑶8α基因連接白介素21基因后 使得白介素21表達在細胞膜上，成為跨膜蛋白；然后培養Κ562細胞一段時間，最后經物理、 化學方式得到純化的Κ562細胞，再對ΝΚ細胞進行培養。CN 102268405 Β公開了一種自體ΝΚ 細胞體外活化擴增培養的方法及其專用培養基。該方法是利用如下成套培養基并同時添加 飼養細胞體外活化擴增自體ΝΚ細胞：由培養基1、培養基2和培養基3組成的成套培養基;所 述培養基1是在干細胞生長培養基中添加人白細胞介素2、人白細胞介素12、人白細胞介素 15、人白細胞介素18、植物血凝素、抗人Τ細胞CD3單克隆抗體和離體的人血漿得到的液體培 養基;所述培養基2與所述培養基1相比，所述培養基2中無所述植物血凝素和所述抗人Τ細 胞CD3單克隆抗體，其它成分均與所述培養基1的相同；所述培養基3與所述培養基2相比，所 述培養基3將所述培養基2中的所述離體的人血漿替換為離體的人ΑΒ血清，其它成分均與所 述培養基2的相同。CN 103849599 Α公開了一種高效擴增自體ΝΚ細胞的培養基及培養方法。 所述培養基內含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細 胞介素12(IL_12)、腫瘤壞死因子a(TNFa)和抗CD3抗體，可以高效擴增和活化NK細胞，從而 獲得大量高活性的以NK細胞為主的免疫細胞回輸人體，在抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節 相關疾病的治療中具有顯著療效。根據本發明的高效擴增自體NK細胞的培養基及培養方 法，其由細胞培養用培養基和添加于所述細胞培養用培養基的添加因子構成，用于大量培 養擴增自體活化的NK細胞，其特征在于，所述添加因子包含有白細胞介素2(IL-2)、白細胞 介素15(IL-15)、白細胞介素7(IL-7)、白細胞介素12(IL-12)、腫瘤壞死因子a(TNFa)和抗 CD3抗體。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的之一在于提供一種殺傷能力大于90%的新型的用于NK細胞體外擴 增的培養基及NK細胞體外擴增的方法；
[0006] 本發明的目的之二在于提供一種培養規模達到20L且可平行放大用于規模化生產 的用于NK細胞體外擴增的培養基及NK細胞體外擴增的方法；
[0007] 本發明的目的之三在于提供一種能實現NK細胞短時間內爆發性增殖的用于NK細 胞體外擴增的培養基及NK細胞體外擴增的方法。
[0008] 第一方面，本發明提供一種用于NK細胞體外擴增的培養基，按體積百分含量包括 如下組分:淋巴細胞無血清培養基100 %或RPMI1640培養基1~90 %和淋巴細胞無血清培養 基10~99%的混合物，以及血清替代物和白介素2;其中，所述血清替代物的濃度為0.5~ 4g/L，例如可以是 0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、lg/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、 2.2g/L、2.5g/L、3g/L、3.2g/L、3.5g/L、3.8g/L、3.9g/L 或 4g/L，所述白介素 2的濃度為 50~ 500yg/mL，例如可以是 50yg/mL、5 lyg/mL、52yg/mL、53yg/mL、55yg/mL、56yg/mL、58yg/mL、60 yg/mL、65yg/mL、70yg/mL、75yg/mL、80yg/mL、85yg/mL、90yg/mL、95yg/mL、100yg/mL、110yg/ mL、120yg/mL、130yg/mL、140yg/mL、150yg/mL、160yg/mL、170yg/mL、180yg/mL、200yg/mL、 220yg/mL、240yg/mL、250yg/mL、280yg/mL、300yg/mL、320yg/mL、350yg/mL、380yg/mL、400μ g/mL、420yg/mL、450yg/mL、480yg/mL或 500yg/mL。
[0009] 本發明中，白介素2的作用是刺激淋巴細胞的生長，血清替代物、淋巴細胞無血清 培養基以及RPMI1640培養基的作用均為供給和補充細胞營養物質。
[0010] 優選地，所述培養基按體積百分含量包括如下組分:淋巴細胞無血清培養基:4〇~ 50%和RPMI1640培養基:50~60%，以及血清替代物和白介素2。
[0011]優選地，所述血清替代物的濃度為1~3g/L。
[0012] 優選地，所述白介素2的濃度為200~300yg/mL。
[0013] 第二方面，本發明提供如第一方面所述的培養基進行NK細胞體外擴增的方法，包 括制備跨膜結合蛋白為白介素15或白介素21的K562細胞的步驟，所述K562細胞包括引導 肽、跨膜結合蛋白、分子膜定位蛋白和膜蛋白；所述引導肽為非病毒引導肽;所述分子膜定 位蛋白為004;所述膜蛋白為001371^、0086、0019和0064的混合物;所述跨膜結合蛋白與膜蛋 白的相應序列通過2A序列串聯。
[0014] 本發明K562細胞的跨膜結合蛋白與膜蛋白的序列連接方式采用2A方式串聯，而現 有技術均采用病毒相連，使得本發明在臨床細胞制備和應用上更安全。其中，CD137L能與T 細胞的CD137特異性結合，刺激分泌IFN-，從而刺激淋巴細胞的增殖;CD19能提升NK細胞活 性，激活NK細胞靶向功能;CD64和CD86起到誘導NK細胞增殖的作用。
[0015] 在本發明中，制備所述K562細胞的具體步驟如下：
[0016] (1)人工合成GM-CSF序列、IL-21/15序列、CD4序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序 列和CD64序列，并將IL-21/15序列、CD137L序列、CD86序列、CD19序列和CD64序列通過2A序 列串聯，插入到帶有抗生素標記的真核表達載體中；
[0017] (2)將步驟（1)得到的真核表達載體測序，正確后進行純化，再與帶有轉座酶的質 粒共轉染到K562細胞中，加入抗生素進行加藥處理，獲得陽性轉染細胞；
[0018] (3)將步驟（2)得到的陽性轉染細胞再加入抗生素進行加藥處理，流式細胞儀分 選，獲得高純度轉染K562細胞；
[0019] (4)再經過加藥處理和5~20次的流式細胞儀分選，獲得100%陽性轉染的K562細 胞，陽性細胞經穩定傳代20代以上，獲得基因組整合外源基因的穩定轉染細胞系；
[0020] (5)將步驟(4)獲得的穩定轉染細胞系再進行流式細胞儀分選，獲得基因組整合外 源基因高表達的穩定轉染細胞系。
[0021] 作為優選技術方案，所述方法包括以下步驟：
[0022] (1)制備所述跨膜結合蛋白為白介素15的K562細胞；
[0023] (2)將所述NK細胞培養基、CD16單克隆抗體與外周血單個核細胞共培養；
[0024]任選地，步驟(2'）：將所述NK細胞培養基、⑶16單克隆抗體、步驟（1)所述跨膜結合 蛋白為白介素15的K562細胞與外周血單個核細胞共培養；
[0025] (3)在培養的后續過程中，添加所述NK細