一種同步分離臍血prp、臍血血漿和臍血細胞的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于細胞血漿分離技術領域，具體涉及一種同步分離臍血PRP、臍血血漿和 臍血細胞試劑盒及使用方法。
【背景技術】
[0002] 高濃度血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)，是利用血液制作的富含血小板 的高濃度血漿，一般用自體外周血制備。人體的血小板在高濃度狀態下，能夠產具有細胞粘 合功能的蛋白質(fibrin，中文名稱:纖維連接蛋白、纖粘蛋白），可以促進血小板大量分泌 有促進傷口、組織愈合及細胞再生的多種生長因子，所以PRP也叫做富含生長因子血漿 (plasma-rich growth factorsARGFsDlRP具有迅速止血、止痛、加速傷口愈合的作用， 可極大程度減輕術后疤痕的形成，從上世紀九十年代中期開始，被廣泛應用于各種外科手 術、心臟手術以及整形手術，目前亦廣泛用于醫學美容方面。PRP抗衰老修復的原理，是根據 生長因子的強大再生力量，促使肌膚新生而成。PRP中主要生長因子成分為① TGF(變形生長 因子）：促進血管上皮細胞修復再生;②FGF(纖維細胞生長因子）：激發新活細胞，加速組織 修復;③EGF(表皮生長因子）：修復上皮細胞，加速血管生長，加快組織修復;④H)GF(血小板 衍生生長因子）：產生膠原蛋白，促進血管生長，激活細胞再生；⑤VEGF(血管內皮生長因 子）：強力修復組織，產生膠原蛋白，激生透明質酸。臍血PRP分泌各種因子含量能力更強及 臍血血漿富含的生長因子更強大，同一血型的臍血PRP止血、止痛、加速傷口愈合的作用及 醫學美容方面會慢慢體現。
[0003] 《科學》雜志公布的2014年年度十大科學突破第二項為:年輕者的血液修復年邁者 的健康問題。研究人員證明，來自年輕小鼠的血液，甚或只是來自年輕小鼠血液中的一個叫 做GDF11的因子，能夠讓較老邁的小鼠的肌肉和大腦"返老還童"，而⑶F11因子是血漿中的 一種成分，此項發現開啟了阿爾茨海默氏癥患者接受年輕捐贈人的血漿等多項臨床試驗。 相對于年輕人血漿，臍血血漿富含更多、更原始的各種因子，治療效果毋庸置疑比年輕人血 漿效果好。近期在細胞培養上很多用臍血血清代替胎牛血清，并取得非常滿意的效果。臍血 血漿臨床及科研應用會越來越廣，所以在分離臍血細胞時高質量分離出臍血血漿非常有價 值。
[0004] 臍血中含有大量的干細胞，干細胞是具有自我更新、高度增殖和多項分化潛能的 細胞群體。這些細胞可以通過分裂維持自身細胞的特性和數量，又可進一步分化為各種組 織細胞，從而在組織修復等方面發揮積極作用。隨著科技的發達，利用臍帶血中的干細胞可 治療多種疾病。臍帶血中含有非常豐富的造血干細胞(HSC)，可以重建人體造血和免疫系 統，可用于造血干細胞移植，治療血液系統、免疫系統，以及遺傳代謝性及先天性疾病。因 此，臍血已成為造血干細胞的重要來源，已經被廣泛地應用于臨床，是寶貴的人類生物資 源。
[0005] 在分離臍血細胞同時分離分離出臍血PRP、臍血血漿，具有很大的臨床應用價值， 現有技術中尚沒有涉及同步分離三種成分的技術，本試劑盒滿足了同步分離臍血PRP、臍血 血漿和臍血細胞，填補了技術上的空白。采用本申請所述的分離試劑盒以及分離方法，不僅 可使臍血PRP中血小板濃度增加一倍多，紅細胞數成數量級較少;并且分離獲得的臍血血漿 純度高，鏡檢下幾乎沒有紅細胞、血小板、單個核細胞和粒細胞;再者，分離獲得的臍血細胞 純度可達到95%以上，紅細胞和血小板殘留率小，極大地避免了由于上述組分導致的過敏 風險;而且與常規分離技術相比，在分離臍血細胞步驟中降低了一半分離試劑的使用劑量， 有效降低分離成本。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細胞試劑盒及使用 方法，采用本試劑盒同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細胞，填補了技術上的空白。
[0007] 本發明首先提供一種臍血細胞分離液，是將40%聚蔗糖液或粉狀Fi-coll-400以 Hank's液配制成濃度為9%聚蔗糖液;再將60%復方泛影葡胺注射液以Hank's液配制成濃 度為34%的復方泛影葡胺溶液，最后將聚蔗糖液和復方泛影葡胺溶液按體積比50:19.11的 比例混合，0.22μπι過濾除菌制成臍血細胞分離液。
[0008] 作為優選，分離液的質量濃度為1.075±0.001g/ml，
[0009] 上述的臍血細胞分離液用于制備用于臍帶血分離的試劑盒；
[00?0]上述的試劑盒，包含有A號稀釋液、B號分離液和C號液為洗滌液；
[0011] 上述的試劑盒還包含有耗材；
[0012] 所述A號稀釋液，是PBS溶液，其pH 7 · 4±0 · 1;
[0013] 作為優選，A號稀釋液還添加有人血白蛋白，其中人血白蛋白添加的體積比終濃度 為 1-3% ;
[0014] 其中臍血血漿的制備方法，是將臍帶血在2000-2500rpm離心20-30分鐘后，吸取上 層血漿獲得的。
[0015] 所述(：號洗滌液為0.9%生理鹽水或?!17.4±0.1不含0&2+和1%2+的？83溶液。
[0016]利用上述的試劑盒可同步分離臍血中的臍血PRP、臍血血漿和臍血細胞，包括如下 的步驟：
[0017] 1)血漿初分離：
[0018] 將臍帶血分裝到離心管a中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后，吸取上層血漿和少 量血小板層到離心管b中；
[0019] 2)臍血細胞初分離：
[0020] 向步驟1)的離心管a中加入A號液，充分混勻后，再沿管壁加入到加有B號液的離心 管中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后使溶液分成四層;收集第一層到離心管c中，把第二層 細胞放入離心管d中，用C號液混勻離心管d后，以1800-2000rpm離心5-10分鐘，棄去上清留 沉淀重新用C號液懸起，重復洗滌得臍血細胞；
[0021] 3)血漿二次純化：
[0022] 將離心管b和離心管c以2000-2500rpm離心5-10分鐘后，吸取離心管b上清液即為 臍血血漿
[0023] 4)臍血PRP的濃縮：
[0024]去除離心管c的上清液，將離心管b和離心管c的沉淀用臍血血漿懸浮即為臍血 PRP〇
[0025]作為優選，步驟2)制備的臍血細胞進行二次純化：向步驟2中獲得的臍血細胞的離 心管d中加入A號稀釋液，吸管吹打均勻后沿管壁加入到事先加有B號液的離心管中，2000-2500rpm離心20-30分鐘后使溶液分成四層，收集第二層細胞放入離心管中，加入C號液充分 混勾，以1800-2000rpm離心5-10分鐘，棄去上清留沉淀重新懸起，重復洗滌既得所需二次純 化臍血細胞。
[0026]本發明通過臍血PRP兩部分濃縮，血小板濃度增加一倍多，紅細胞數成數量級較 少;通過血漿二次純化，分離獲得的臍血血漿純度高，鏡檢下幾乎沒有紅細胞、血小板、單個 核細胞和粒細胞;通過臍血細胞二次純化，分離獲得的臍血細胞純度可達到95 %以上，紅細 胞和血小板殘留率小，極大地避免了由于上述組分導致的過敏風險；分離第一步血漿初分 離，與常規分離技術相比，在分離臍血細胞步驟中降低了一半分離試劑的使用劑量，有效降 低分離成本。
【具體實施方式】
[0027]下面結合實施例對本發明進行詳細的描述。
[0028]實施例1:制備用于同步分離臍血PRP、臍血血漿和臍血細胞的試劑盒
[0029] 1、試劑配制
[0030] 本發明用于分離外周血單個核細胞的試劑盒包括以下試劑：
[0031] (1)A號液:稀釋液為PBS pH 7.4±0.1，不含Ca2+和Mg2+，其中加入1-3%人血白蛋 白；其中PBS溶液的配制方法如下：
[0032]母液的配制：
[0033] 0.2M Na2HP〇4:稱取71.6g Na2HP〇4-12H2〇,溶于 1000ml水
[0034] 0.2M NaH2P〇4:稱取31.2g NaH2P〇4-2H2〇,溶于 1000ml水
[0035] 先配0.21?8(口!1 = 7.4，1001111):取1911110.2111〇1/1的恥!12?04,8111110.2111〇1/1的 Na2HP〇4,即可。
[0036] 然后將0.2M ΡΒ(ρΗ=7·4)按如下稀釋即0.01M ΡΒ(ΡΗ=7·4):取50ml 0.2M PB，加 入NaC