一種全懸浮培養mdck細胞的低血清培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物制品技術領域，具體涉及一種全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養 基。
【背景技術】
[0002] 近幾年流感(禽流感)大面積爆發，嚴重影響了人和禽類動物的健康，接種疫苗仍 是目前預防流感(禽流感）的最主要手段。傳統流感疫苗的生產運用雞胚培養法，該方法存 在培養過程微生物污染幾率高、產品內毒含量高、注射副反應大、廢物有環境污染處理成本 高、流感大流行爆發時雞胚供應困難和生產周期長等工藝缺點，開發動物細胞基質的疫苗 流感勢在必行。
[0003] MDCK細胞（Madin-Darby canine kidney cells)是從犬腎組織中分離培養獲得 的上皮樣貼壁傳代細胞，該細胞培養工藝相對簡單、生長快且對流感病毒敏感，是目前生產 流感疫苗常用的細胞系之一。傳代細胞的規模化培養方式經歷了轉瓶培養、微載體培養、片 狀載體培養和單細胞懸浮培養等過程。
[0004] 懸浮培養一般指的是非貼壁依賴性細胞的一種培養方式，是細胞經過馴化后可完 全懸浮于培養基中生長或維持。由于細胞本身的特性，有的細胞有很容易馴化成懸浮培養 型的，也有部分細胞是很難馴化成功的。由于MDCK細胞已具有商業前景，近年來研究人員進 行了大量馴化研究，1997年，美國Albrecht Groner等人將MDCK細胞接種入轉瓶中并調整轉 速為16rpm(正常速率為3rpm)，使細胞不能有效的貼附到瓶壁上而懸浮于培養基中生長，利 用此法連續傳代培養便可得到MDCK懸浮細胞系，且該細胞對流感病毒敏感，此后有關MDCK 懸浮培養的研究和應用的報道很多，歐洲諾華公司和美國醫學免疫學公司已經有MDCK細胞 基質的流感疫苗上市，取代了傳統雞胚工藝。據報道，在我國已有多株馴化的可全懸浮培養 的MDCK細胞，但是批培養的密度都不高，大多在2.0 X 106/mL左右，其主要原因還是沒有相 應配套的全懸浮培養的培養基，實際應用中許多用戶高價買來的無血清培養中加3-5%的新 生牛血清才能正常培養細胞。無血清培養基配方中要添加大量血清替代物如：重組人表皮 細胞生長因子、氫化可的松、胰島素、前列腺素和甲狀腺素等激素，這些添加物的價格通常 是血清價格的好多倍。本發明提供一種以DMEM/F12為基礎的低血清培養基，使用時添加3-5%新生牛血清，價格低，配制簡單，能很好的支持MDCK細胞的全懸浮培養。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養基，價格低廉，配制方法簡 單，應用其培養MDCK細胞，細胞密度能夠大大提高。
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養基，本申請人 經試驗發現，在DMEM/F12培養基中直接添加支持MDCK細胞低血清培養的添加物時會增加培 養基的滲透壓，從而影響細胞生長。因此，本申請人以DMEM/F12培養基配方(Gibco公司，貨 號：12500)為基礎培養基，在此基礎上添加添加物，并在pH緩沖鹽碳酸氫鈉2200mg/L的情況 下，將基礎培養基中氯化鈉含量由6996mg/L降至5000-6500mg/L，此時滲透壓為280-310mmol/kg，具體的添加物如下：（mg/L) 氯化鎳NiCh · 6H2O 0.000195 七鉬酸銨(ΝΗ4)6Μ〇7〇24·4Η2〇 0.00124 氯化亞錫SnCl2 · 2Η20 0.000095 偏釩酸銨 NH4VO3 0.000585 硅酸鈉Na2Si03 · 9Η20 0.061 維生素 A 0.1-0.2 維生素 E 0.05-0.1 人轉鐵蛋白 5-10 重組膜島素 10-20 谷胱甘肽 0.1-0.5 亞硒酸鈉 0.003-0.006 植物蛋白水解物(HyPep 1510) 2000-2500 重組人血白蛋白 200-300 PF68 800-1200。
[0007] 其中，氯化鎳、七鉬酸銨、氯化亞錫、偏釩酸銨、硅酸鈉和亞硒酸鈉為細胞補充微量 元素，細胞在低血清時增加細胞的代謝功能，維持細胞的活性。
[0008] 維生素 A和維生素 E為脂溶性維生素，維生素 A有增強細胞免疫功能的作用，維生 素 E的主要作用是作為抗氧化劑，它能阻止游離基的積累，增加細胞代謝，提高細胞活性。
[0009] 轉鐵蛋白能結合鐵離子，減少其毒性和被細胞生長所利用。
[0010] 重組胰島素可促進糖和氨基酸的轉運，提高合成代謝降低分解代謝，刺激細胞生 長。
[0011]谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用 和整合解毒作用，還參與生物轉化作用，從而把機體內有害的毒物轉化為無害的物質，增加 細胞活性。
[0012] 植物蛋白水解物主要是小分子肽和氨基酸組成，為細胞的主要營養物質。
[0013] 重組人血白蛋白作為細胞的營養物質，也是激素、脂類等物質的轉運載體，還有調 節pH值和維持滲透壓的作用。
[0014] PF68為表面活性劑，主要是提高細胞懸浮培養時的抗剪切力，增加細胞活性。（在 脂溶性物質溶解乳化時起乳化劑的作用，量少在總配方中忽略此量）。
[0015] 本發明的第二個目的是提供一種全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養基的制備方 法，是將脂溶性原料乳化凍干后與其它原料混合，磨細即得。
[0016] 使用時，用注射用水溶解，每升加2200mg NaHC03,用1N氫氧化鈉或1N鹽酸調pH值 至7.1-7.2。
[0017] 本發明的第三個目的是提供一種全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養基的制備方 法，將脂溶性原料乳化后（不需要凍干）與其它原料依次溶解于注射用水，然后每升加入 2200mg NaHC03，最后用1N氫氧化鈉或1N鹽酸調pH值至7.1-7.2。
[0018] 本發明的第四個目的是提供上述培養基在MDCK細胞全懸浮培養中的應用。
[0019] 本發明的第五個目的是提供應用上述的培養基全懸浮培養MDCK細胞的方法，在配 制好的培養基中加入體積百分含量為3-5%的新生牛血清。
[0020] 本發明的第六個目的是在權利要求1的培養基中加入體積百分含量為3-5%的新生 牛血清，接種MDCK細胞，在37 °C，11 Orpm的轉速下搖床培養。
[0021] 本發明的培養基價格低廉，配制方法簡單;在本發明的培養基中加入體積百分含 量為3-5%的新生牛血清，接種MDCK細胞，能提高細胞密度，使其增至4.21 X 106/ml，此時，細 胞活力仍達92.3%。
【附圖說明】
[0022]附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中： 圖1為應用本發明的培養基懸浮培養MDCK細胞，細胞生長情況圖；其中，圖A為MDCK細胞 初培養時細胞生長情況圖；圖B為MDCK細胞培養96小時后的細胞生長情況圖。
【具體實施方式】
[0023]以下的實例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方 法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0024]材料來源： 培養基和血清:DMEM/F12(Gibco公司，貨號：12500);新生牛血清(蘭州民海生物工程有 限公司，批號：20141028); 氨基酸:L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰 胺，甘氨酸，L-組氨酸，L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-賴氨酸，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸， L-絲氨酸，L-蘇氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-纈氨酸，L-胱氨酸，以上均采購自Solarbio公 司； 維生素:氯化膽堿，次黃嘌呤鈉，煙酰胺，泛酸，鹽酸腐胺，鹽酸吡咳醇，鹽酸硫胺素，胸 苷，維生素 B12，D-生物素，葉酸，核黃素，維生素 A，維生素 E，亞油酸，硫辛酸，均為Sigma公司 生產； 碳水化合物:D-葡萄糖，購自國藥集團； 生長因子/激素:重組胰島素，人轉鐵蛋白，均為Sigma公司生產； 植物蛋白水解物:HyPep 1510，Shef f i e 1 d公司生產； 其它:谷胱甘肽，吐溫-80(均為Sigma公司生產）;PF-68(Gibco生產，89-5080IP); 化學試劑為國產分析純。
[0025] 實施例1 本發明的全懸浮培養MDCK細胞的低血清培養基的配方如下，默認單位:mg/L;其中，下 劃線部分為DMEM/F12培養基成分： 1)無機鹽和微量元素： 氯化鈣 CaCl2 116.6 氯化鉀KC1 311.8 硫酸鎂 MgS〇4 48.84 無水磷酸氫二鈉Na2HP04 71.02 磷酸二氫鈉 NaH2P〇4-H2〇 62.5 氯化鎂 MgCl2 28.64 硫酸銅CuS〇4 · 5H20 0.0013 硝酸鐵Fe(N03)3 · 9H20 0.05 硫酸亞鐵FeS〇4 · 7H20 0.417 硫酸鋅ZnS〇4 · 7H20 0.432 丙酮酸鈉C3H3Na03 55 氯化鎳NiCh · 6H2O 0.000195 七鉬酸銨（ΝΗ4)6Μ〇7〇24·4Η 2〇 0.00124 氯化亞錫 SnCl2 · 2Η20 0.000095 偏釩酸銨 NH4VO3 0.000585 硅酸鈉 Na2Si03 · 9Η20 0.061 亞硒酸鈉Na2Se03 0.005 氯化鈉NaCl 6400 2) 氨基酸 L-丙氨酸 4.45 L-精氨酸 147.5 L-天冬酰胺 7^