一株產減毒類脂A的Cronobacter sakazakii突變株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株產減毒類脂A的Cronobacter sakazakii突變株及其應用，屬于基 因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 阪崎克羅諾腸桿菌(Cronobacter sakazakii)是一種自然界中廣泛存在的食源性 革蘭氏陰性致病菌，主要污染嬰兒配方奶粉。它可以引起新生兒腦膜炎、敗血病、菌血癥及 壞死性小腸結膜炎等疾病。近些年的研究表明，有些革蘭氏陰性菌的致病能力與其外膜類 脂A的分子結構密切相關，但關于阪崎克羅諾腸桿菌類脂A分子修飾及作用還有待研究。
[0003] 細菌細胞膜表面的LPS并不是一個穩定的結構，細菌處于特定條件下是會對其結 構進行不同的修飾，這些修飾賦予了細菌對抗菌劑的抗性，以及提升了入侵宿主的能力。 PmrA-PmrB是一個二元調控系統，調控多種發生在LPS上的化學修飾，并且它可以在多種細 菌物種內行使作用。PmrA-PmrB的修飾作用可以增強細菌對陽離子抗菌肽粘菌素的抗性以 及細菌在巨噬細胞中的復制能力。同時，PmrA-PmrB二元調控系統還對細胞的生命活動有著 整體的影響，可以影響細菌的毒性。
[0004] 疫苗佐劑(Vaccine adjuvant)，又稱免疫增強劑（Immunomodulator)，是在疫苗接 種過程中輔助疫苗作用、改善或增強疫苗作用效果的一類物質。免疫佐劑需具備有效激起 非特異性免疫反應，增強機體對某疫苗的免疫原性或保護性應答的能力。
[0005] 如何降低菌株毒性以便制備疫苗佐劑是目前亟需解決的問題之一。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供C. sakazakii的類脂A分子中修飾相關的基因工 程菌，檢測該修飾對菌株的影響。
[0007] 本發明的第一個目的是提供一種Cronobacter sakazakii的基因工程菌，所述基 因工程菌缺失了 ESA-03574基因片段。
[0008] 在本發明的一種實施方式，所述ESA-03574基因片段的核苷酸序列是SEQ ID N0:1 的序列。
[0009] 在本發明的一種實施方式，所述基因工程菌為無抗性C.sakazakii BAA894AESA-03574,以Cronobacter sakazakii BAA894為出發菌、缺失了核苷酸序列為SEQ ID NO: 1 的 ESA-03574基因片段。
[0010] 在本發明的一種實施方式，所述基因工程菌的構建方法如下：將人工構建的ESA-03574 敲除片段電轉化入含 pKD46 質粒的 C. sakazakii BAA894,獲得突變株 C. sakazakii BAA894 Δ ESA-0 3574-1 oxPkan，再化轉入 pKD-Cre 質粒（參考文獻：Yaning Han, Construction of Monophosphoryl Lipid A Producing Escherichia coli Mutants and Comparison of Immuno-Stimulatory Activities ofTheir Lipopolysaccharides , Marine Drugs，2013，11，363-376)，通過位點特異性重組敲除卡那霉素抗性基因；去除pKD- Cre質粒后獲得無抗性lipidA的基因結構突變的基因工程菌。
[0011]在本發明的一種實施方式，所述ESA-03574敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID N0:2 所示。
[0012] 本發明的第二個目的是提供一種降低Cronobacter sakazakii對陽離子抗菌肽抗 性和/或降低Cronobacter sakazakii對HEK4細胞刺激作用的方法，所述方法是敲除 Cronobacter sakazakii菌的ESA-03574基因片段。
[0013] 在本發明的一種實施方式，所述Cronobacter sakazakii菌株為BAA894;所述ESA-03574 基因片段的核苷酸序列是 SEQ ID NO: 1 的序列。
[0014] 在本發明的一種實施方式，敲除了ESA-03574基因片段的Cronobacter sakazakii 菌在低pH(比如pH 5)條件下作用。
[0015] 在本發明的一種實施方式，所述降低Cronobacter sakazakii對HEK4(即HEK-Blue hTLR4)細胞刺激作用，檢測方法如下：
[0016] HEK-Blue hTLR4細胞為弱貼壁細胞，細胞培養體系：DMEM高糖培養基+10%FBS+ 100U/mL-100yg/mL Pen-Strep雙抗+100yg/mL Normocin多效抗生素，于37°C，5%C02條件 下培養，并隔代添加 lXHEK-Blue篩選液進行篩選。細菌菌體收集后用無熱源磷酸緩沖液 (PBS)洗兩次，再用PBS梯度稀釋加入96孔板，每孔0.02mL，無菌PBS作為對照；HEK-Blue hTLR4細胞收集計數后用HEK-Blue?檢測液重懸，將0.18mL細胞懸液接種到96孔板，每孔1.4 X 105個細胞，C · sakazaki i BAA894和C · sakazaki i BAA894 Δ ESA-03574細菌和HEK-Blue hTLR4細胞混合培養12h檢測0D63QnJ^吸光度，吸光度讀數值與TLR4信號通路激起的強度成 正比。
[0017] 本發明的第三個目的是提供所述基因工程菌在陽離子抗性肽及疫苗佐劑方面應 用。
[0018] 本發明的有益效果：
[0019] 本發明通過將Cronobacter sakazakii菌株的ESA-03574基因片段進行敲除，使 Cronobacter sakazakii菌株對陽離子抗菌肽抗性降低了32倍、更容易被抗菌肽殺死， Cronobacter sakazakii突變株細胞在低pH下激活TLR4免疫通路的能力減弱，對TLR4的刺 激能力減弱，對細胞毒性減弱，對后期免疫反應產生細胞因子開發疫苗佐劑有一定的幫助， 有利于疫苗佐劑的開發。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 pH 7 ·0和pH 5 ·0條件下Cronobacter sakazakii BAA894 Δ ESA-03574的類脂 A的ESI/MS分析；
[0021 ] 圖2 pH 5.0條件下ESA-03574對ESA-02008基因轉錄的調控；
[0022] 圖3 BAA894野生型和突變株的外膜滲透性；
[0023] 圖4 C. sakazaki i BAA-894和C. sakazaki i ΒΑΑ-894Δ ESA-03574突變菌株對TLR4 信號通路的激活能力。
【具體實施方式】
[0024] 類脂A的的結構鑒定與分析：
[0025] ESI/MS分析:類脂樣品溶于氯仿/甲醇溶液(4:l，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer質譜儀上進行質譜檢測。采用ESI離子源，陰離子檢測模式，檢測范圍小 于m/z 2500。
[0026] 實施例 1 突變株C.sakazakii BAA894AESA-03574的構建
[0027] UESA-03574基因敲除片段的獲得
[0028]采用化學全合成或PCR分步擴增的方法獲得ESA-03574基因敲除片段，其兩端分別 為ESA-03574基因上下游同源臂、中間為帶有LoxP位點的kan片段。ESA-03574基因敲除片段 的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。將ESA-02008和ESA-03574基因敲除片段分別克隆到 pBlueScript II SK( + )，獲得重組質粒pBlueScript II SK( + )-ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。以該質粒為模板，可以擴增獲得敲除片段ESA-03574U-Lkan-ESA-03574D。
[0029] 2、敲除感受態的制備及電轉化
[0030] 接種帶有Red重組輔助質粒pKD46(Datsenko K A,Wanner B L.One-Step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products . ProcNatlAcadSci USA ,2000 ,97(12) :6640-6645)的 CronobactersakazakiiBAA894于含 100yg/mL氨節青霉素的LB液體培養基中，30°C，200rpm 過夜培養。按2 %接種量轉接lOOmL LB液體培養基，30 °C，200rpm培養至0D6q() = 0.2時加入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmo 1 /L)誘導重組酶的表達，繼續培養0D6QQ = 0.5，將培養液冰浴半小 時后轉入預冷的5〇1111^離心管中，4<€，4000印1]1離心1〇111；[11收集菌體，沉淀用預冷的10%甘油 洗滌3次，最后用lmL 10 %甘油懸浮，每管80yL分裝至預冷的無菌EP管中。
[0031 ] 將500-1000ng ESA-03574敲除片段加入感受態細胞中，混勻，冰浴15min，1.5kv電 擊5ms，30 °C孵育2h，涂布30yg/mL卡那霉素的LB固體平板，30 °C培養，挑取轉化子于含30yg/ mL卡那霉素及100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，PCR驗證結果。
[0032] 3、突變株抗性標記的去除
[0033]將PCR驗證陽性的菌株接種含30yg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，42°C過夜培 養，將培養液劃線SOyg/mL卡那霉素的LB固體平板，37 °C培養，挑取單菌落驗證其對氨芐青 霉素的敏感性，將含有卡那霉素抗性并對氨芐青霉素敏感的菌株命名為和 C. sakazaki iBAA894AESA_03574: : kan并保藏。以此為出發菌株做感受態，轉入pKD-Cre質 粒，42 °C熱激表達FLP酶，將陽性菌株于含100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，加 入L-阿拉伯糖(終濃度為30mmol/L)誘導Cre重組酶的表達，介導LoxP位點特異性重組，PCR 驗證挑選轉化子。將PCR