一種園林廢棄物降復合解菌劑制備及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于環境生物技術領域，具體涉及一種園林廢棄物高溫降解纖維素的復合菌劑的制作備及其應用。
【背景技術】
[0002]園林廢棄物指園林植物自然凋落或人工修剪所產生的枯枝、落葉、草肩、殘花、樹木與灌木剪枝及其它植物殘體等，主要成分為難降解的纖維素和半纖維素。近年來，我國園林廢棄物每年8%_10%的速度遞增，給城市綠色化進程帶來了巨大阻力，目前我國處理園林廢棄物的方式主要為焚燒和填滿，這兩種處理方式不僅浪費了可再生資源還造成了嚴重的環境污染。利用生物堆肥降解園林廢棄物是目前最為綠色環保、無害的方法。
[0003]園林廢棄物中含有大量的木質素、纖維素等難降解的物質，導致堆肥效率低、周期長，大大限制了園林廢棄物的再利用價值。僅靠自身堆肥發酵，是一個長期且較難實現的(Bernabe G.A.， Kobelnik M., Almeida S.， et al.Thermal behav1r of ligninand cellulose from waste composting process.Journal of Thermal Analysis andCalorimetry，2013,111(1): 589-595.)。堆肥中園林廢棄物的降解是在微生物代謝過程中產生的一系列酶的共同作用下完成的。所以接種外源降解纖維素的菌株或菌劑在堆肥進程中顯得尤為重要。纖維素降解菌能完全水解纖維素，自然界中，纖維素主要是被微生物降解，主要是細菌、真菌和放線菌。真菌主要在中溫條件下，酶活最大，如木霉、青霉屬、曲霉屬、根霉屬等。細菌和放線菌的研究和應用均較少。堆肥過程中纖維素降解主要發生在高溫期，而真菌主要在中溫條件下，酶活最大，隨著堆肥過程溫度的上升，真菌活菌數量及其產生的酶活性大大降低，這就限制了產纖維素酶霉菌在堆肥中的利用。耐高溫纖維素降解菌的篩選和應用是解決上述問題的有效措施。很多纖維素降解菌都是針對玉米秸桿、稻草、麥秸等農業廢棄物，很少有專門針對園林廢棄物纖維素材料的降解菌的篩選和利用研究。中國專利申請“一株高溫纖維素降解菌及其應用”(專利申請號:201410018582.6)公布了一株從園林廢棄物高溫期堆肥樣品中分離的高溫纖維素降解菌地芽孢桿菌，纖維素酶活性僅為7.8 U/ml，該菌為細菌。關于從園林廢棄物堆肥中分離耐高溫纖維素降解放線菌的報道較少。
[0004]有觀點認為單一菌株與混合菌劑相比，纖維素酶活低很多。因為纖維素酶是一系列酶系共同作用的結果(Martinez AT , SPeranza M, Ruiz-Duenas F J , et al.B1degradat1n of Iignocellulosics: microbial, chemical, and enzymaticaspects of the fungal attack of lignin[J].1nt Microb1l，2005，8(3):195-204.)0史玉英(史玉英，沈其榮.纖維素分解菌群的分離和篩選[J].南京農業大學學報.1996，19(3):59 -62.)等最早把篩選到的纖維素降解菌混合培養，并對單一菌株和混合菌株的酶活進行了比較，結果混合菌株纖維素酶或比任何一個單一菌株都要高;崔宗均等(崔宗均，李美丹，樸哲，等.一組高效穩定纖維素分解菌復合系MCl的篩選及功能[J].環境科學，2002，23(3): 36 -39.)在前人研究的基礎上首次把酸堿菌株進行混合，得到pH在適宜范圍內的混合菌株。上述學者的研究表明，幾種高效纖維素降解菌株混合培養所產生的纖維素酶活力要比單一菌株酶活高。
[0005]基于此，本發明通過對園林廢棄物堆肥高溫期樣品進行富集培養，篩選出一系列高溫微生物，主要是高溫放線菌和耐高溫細菌，并將其混合制作成腐熟劑，接種于以園林廢棄物為主要材料的堆肥中，有助于彌補堆肥高溫期土著菌纖維素降解能力的不足，從而加快園林廢棄物堆肥腐熟進程。
【發明內容】
[0006]本發明所要解決的技術問題是:提供一種能加速堆肥處理園林廢棄物降解過程的功能復合菌劑，解決園林廢棄物由于纖維素的難降解性造成堆肥周期長的問題，可在堆肥過程中使纖維素降解加速，縮短發酵周期，提高轉化效率。
[0007]本發明提供的技術方案是:一種具有在高溫條件下能高效降解纖維素功能的復合菌劑，所述復合菌劑包括放線菌和細菌，其中放線菌為高溫紫鏈霉菌(Streptomycesthermov1laceus)，嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)，嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)，微白黃鏈霉菌(Streptomycesalbidof Iavus)和熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)，保藏號分別為CGMCCN0.12133^CGMCC N0.12134、CGMCC N0.12135、CGMCC N0.12136和CGMCC N0.12137，細菌為波茨坦短芽孢桿菌(Brevibacillus borstelensis)，保藏號為CGMCC N0.12138，均保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，所述復合菌劑由各菌株種子液分別等體積混合后進行發酵獲得。
[0008]本發明所述復合菌劑中高溫紫鏈霉菌(Streptomyces thermov1laceus)，嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)，嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomycesthermocarboxydus)，微白黃鏈霉菌(Streptomyces albidof Iavus)，熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)和波茨坦短芽抱桿菌(BrevibaciIIus borstelensis)分別編號為31'1、3了2、3了3、3了4、3了5、？腫1，均已于2016年2月18日為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101)，其保藏號分別為CGMCC N0.12133^CGMCC N0.12134、CGMCC.12135 No、CGMCC N0.12136^CGMCC N0.12137^CGMCC N0.12138，經檢測均存活。
[0009]本發明還提供所述復合菌劑的制備方法，其步驟如下:
(D菌株活化:取本發明微生物4°C保存斜面，5株放線菌分別接種至高氏I號固體平板培養基，I株細菌接種到LB固體平板培養基，在50°C的恒箱中培養3d實現菌株活化；
(2)種子液制備:將步驟(I)中經斜面活化的菌種平板，5株放線菌分別轉接到IL無菌ISP2液體培養基中(成分:酵母浸粉4 g/L，麥芽糖10 g/L，葡萄糖4 g/L，瓊脂16 g/L)，l株細菌轉接到IL無菌LB液體培養基中(成分:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，Nacl10g/L)，pH 7.2-7.4，50 °C、150rpm搖床條件下培養，高溫紫鏈霉菌，嗜熱淀粉酶鏈霉菌，熱普通鏈霉菌和波茨坦短芽孢桿菌培養12h，嗜熱一氧化碳鏈霉菌和微白黃鏈霉菌培養72h，獲得種子液；
(3)液體發酵復合菌劑的制備:上述種子液按6-10%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發酵罐中，進行擴大發酵培養，在溫度50°C、振蕩頻率120 rpm的條件下，高溫紫鏈霉菌，嗜熱淀粉酶鏈霉菌，熱普通鏈霉菌和波茨坦短芽孢桿菌培養24h，嗜熱一氧化碳鏈霉菌和微白黃鏈霉菌培養72h，上述菌液混合均勻，即得到液體發酵復合菌劑。
[0010]進一步地，本發明還提供固態復合菌劑的制備方法:將麥麩與玉米面按照2:1質量比混合后作為菌液吸附劑，與步驟(3)中制得的菌液，按菌液與吸附劑體積質量比I: I混合，制作成固態復合菌劑，堆置1-2周，期間翻動1-2次，即獲得固態復合菌劑，可用于以園林廢物為主要材料的高溫堆肥。
[0011]本發明具有以下有益效果:
本發明涉及菌種是從園林廢棄物與動物糞便混合材料高溫堆肥期樣品中分離而來的一系列高溫放線菌和細菌，具有耐高溫、高效降解纖維素特性的混合菌劑，對園林廢棄物的降解有更好的適應性。本發明中高溫紫鏈霉菌，嗜熱淀粉酶鏈霉菌，嗜熱一氧化碳鏈霉菌，微白黃鏈霉菌，熱普通鏈霉菌和波茨坦短芽孢桿菌菌株間沒有拮抗作用且具有良好的協同作用，這種協同作用可有效的加速堆肥化的進程。本發明菌劑中的微生物種群間具有良好的協同作用，不僅對高溫條件下園林廢棄物具有高效穩定的降解能力，而且對不同環境的適應能力強，菌劑可加速園林廢棄物的堆肥化進程，提高發酵效率，縮短堆肥時間，降低處理成本。
[0012]將本發明所述復合菌劑應用于園林廢棄物高溫堆肥體系中，該混合菌群能在40-70°C高溫內大量產纖維素酶酶，活性可達76 U/ml。本發明制得的復合菌劑接種于以園林廢棄物為主要材料的堆肥中，與不接種的對照相比，能夠提高堆肥進入高溫期的時間、延長高溫期持續時間已經高溫期溫度，降低堆肥C/N比，從而加快堆肥腐熟進程。
[0013]本發明解決了由于纖維素的難降解限制造成園林廢棄物堆肥化速度慢、周期長的問題，可以在堆肥過程中使纖維素降解加速，縮短發酵周期，提高轉化效率，而且對不同環境的適應能力強，以期能達到有效提高園林廢棄物的堆肥效率，從而為園林廢棄物變廢為寶，城市綠色化的進程中提供依據，在園林廢棄物堆肥化處理及資源化利用等方面具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0014]圖1混合菌群與單一菌株產酶活性比較。
[0015]圖26株菌株系統發育樹。
[0016]圖3堆肥過程中堆體溫度變化。
[0017]圖4堆肥過程中碳氮比(C/N比)變化。
【具體實施方式】
[0018]下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。
[0019]實施例1高溫纖維素降解菌種的篩選和鑒定
從北京昌平區某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫初期、高溫中期、高溫后期材料、北京延慶平原造林地區園林綠化廢棄物堆積物中采集樣品；稱取上述新鮮樣品1g放于裝有10粒玻璃珠、并盛有90 ml無菌水的錐形瓶中，置于30°C 150 rpm的搖床中搖30 min，使樣品充分散開，50°C下靜置富集培養24h。用無菌吸管吸取I ml上清液加入到含有9ml無菌水的試管中，此即為10—1樣品稀釋液，再從10—1樣品中取Iml加入到9ml無菌水中，此即為10—2樣品稀釋液，以此類推，得到10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液，然后用移液器吸取100 μ?的10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液于纖維素剛果紅培養基上(培養基組成為:K2HPO4 0.5g，微晶纖維素1.88g，MgS04 0.25g，明膠2.0g，剛果紅0.5g，瓊脂16g，蒸饋水1000ml，pH7.0)，用涂布器把稀釋液均勻涂布于整個平板，并置于50°C培養箱中培養3天。挑選在纖維素剛果紅平板上有明顯透明圈的菌落，進行編號，再進行反復劃線分離純化獲得純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4°C保存進行后續實驗。
[0020]將保藏于4°C的純菌株轉接到CMC-Na培養基(培養基成分:CMC_Na 15.0g,NH4NO3l.0g，酵母膏 1.0g，MgS04.7H20 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸餾水 1000ml，瓊脂 16g，pH 7