一種雞源唾液乳桿菌的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及菌株領域，具體涉及一種雞源唾液乳桿菌的應用。
【背景技術】
[0002] 乳酸菌是人和動物體內腸道正常菌群的一種，其抗病、防病及促生長的作用已有 很多的報道，并且有研究也表明，理想的益生菌菌株最好來自本源動物。乳酸桿菌作為一種 動物體內重要的益生菌，能夠調節腸道菌群的平衡，對常見的腸道致病菌具有廣譜抗菌作 用；增強機體的免疫力和抵抗力、提高乳品質，改善人類對酸奶乳糖不耐受癥狀;提高飼料 利用率、促進動物生長性能和肉品質等許多有益的生理功能。另外，抗生素的濫用帶來的嚴 重危害，導致我們需要一種新型的物質來代替抗生素，目前認為，乳酸桿菌是最佳的抗生素 替代品。但不同來源的乳酸菌的生物學特性不同。因此，對乳酸桿菌菌種的分離純化、研究 其生物學特性是將其進行生產實踐應用中的重要環節。目前，國內外對乳桿菌生物特性的 研究多限于乳品、植物來源的乳桿菌，動物源性的乳酸桿菌雖然也被應用，但對其生物特性 的報道相對較少且不系統全面，唾液乳桿菌作為2010年4月22日衛生部辦公廳關于印發《可 用于食品的菌種名單》的通知中可食用的菌種之一。它具有很多重要的生理功能，就使得唾 液乳桿菌有望成為優良的食品添加劑及可替代抗生素添加劑的優良益生菌之一。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種雞源唾液乳桿菌的應用，其命名為Lactobacillus salivarius C_l_3〇
[0004] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0005] Lactobacillus salivarius C-1-3在纖維素降解方面的應用。
[0006] Lactobacillus salivarius C-1-3作為微生態制劑應用于飼料生產中。
[0007] Lactobacillus salivarius C-1-3在動物性食品保藏中的應用。
[0008] 本發明具有以下有益效果：
[0009] 菌株對常見的致病菌大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌作 用。且該菌株的一個重要的生物學特性是具有纖維素降解能力。經過多次馴化后，該菌株表 現具有較好的抑菌作用及耐酸、耐膽鹽、耐高溫特性。該菌株的成功分離鑒定及生物學特性 研究為今后其在食品和飼料中的應用奠定了理論和試驗基礎。
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明實施例中CM-3菌株的PCR電泳圖，
[0011] 圖中，Μ為2000bp的marker，l為C-1-3菌株16S rDNA基因序列擴增結果；2為空白對 照
[0012] 圖2為本發明實施例中C-1-3菌株的系統發育樹
[0013] 圖3為本發明實施例中C-1-3菌株的生長曲線和耐酸能力。
[0014] 圖4為本發明實施例中對不同菌的抑菌圈的大小效果
[0015] 圖5為本發明實施例中的耐高溫結果
【具體實施方式】
[0016] 為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步 詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發 明。
[0017] 實施例1
[0018] 一材料來源：
[0019] 試驗動物:本地健康散養溜達雞，購于沈陽某生態養雞場。
[0020] 培養基:MRS培養基、SL乳桿菌選擇性培養基;LB培養基、麥康凱瓊脂培養基、羧甲 基纖維素鈉(CMC-Na)固體培養基均購于北京奧博星生物技術有限公司;甘露醇氯化鈉瓊脂 培養基購于杭州天和微生物試劑有限公司。
[0021 ]試驗菌株:雞源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌，均由沈陽農業大學畜牧獸 醫臨床實驗室保存提供。
[0022]二、試驗方法 [0023] (1)乳桿菌分離
[0024] 剪斷頸部血管快速放血致死，迅速無菌取小腸，置無菌平皿中，移至超凈工作臺中 剖開，去掉小腸內容物，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，用滅菌載破片刮取小腸黏膜黏 液，然后用滅菌生理鹽水進行稀釋，依次稀釋至1〇_ 2、1〇_3、1〇_4梯度，各稀釋度都取0.1ml，在 無菌條件下，用接種環劃線種于SL選擇性培養基，置于37°C搖床中培養36小時后，接種到 MRS固體培養基中，37 °C培養24小時。
[0025] (2)乳桿菌鑒定
[0026]進行多次劃線培養后，挑取形態特征與《伯杰氏細菌鑒定手冊》對乳桿菌描述圓 形、表面光滑、乳白色相一致菌落進行革蘭氏染色，選取疑似菌株進行生理生化鑒定，包括 生化反應管試驗，主要測定項目有:苦杏仁苷、水楊苷、麥芽糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖等糖 類發酵試驗、明膠液化試驗、厭氧生長以及葡萄糖酸鹽和15°C生長與否等測定試驗；菌株 16S rRNA鑒定:利用購于上海生工的細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取細菌的基因組，然 后米用165 11^八通用弓丨物27;1^:5'-&區&區1:七區&1：(3(^區區(31:〇&區-3'；14921':5'-ggttaccttgttactt-3'，以提取的基因組作為模板，進行PCR擴增其16S rRNA基因片段，擴增 體系為30yl:PCR mix 15μ1，通用引物每樣ΙμL，基因組ΙμL以及去離子水12yl;PCR反應條件 為：95°C 預變性 5min，94°C 變性 458,50/60°(：退火458,72°(：延伸9〇8,24個循環，72°(：延伸 SmiruPCR完成后，產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳試驗檢驗結果成功與否。擴增成功后送至上 海生工生物工程有限公司進行生工測序，為了測序的準確性，要求雙向測通。測序結果在 NCBI上進行Blast比對，在GenBank中得到幾個與分離菌株序列同源性較高的菌株，將這些 菌株作為參考菌株進行同源性分析。使用Clustal X 1.8把這些參考菌株的序列對齊后，使 用DNA star建立菌株的系統進化樹，分析菌株的同源性。
[0027] (3)菌株生長曲線的測定
[0028]以1 %的接種量接種到MRS培養基中，置于37°C搖床中培養，分別在0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、14、18、22h取樣，測得培養基的pH及采用比濁法，利用分光光度計測得 菌液在OD6QQnm處的吸光度，然后以培養時間為橫坐標，以pH和OD6QQnm值為縱坐標，繪制生長 曲線。
[0029] (4)菌株體外抑菌試驗
[0030]抑菌試驗參考劉冬梅等人用牛津杯法測定益生菌的抑菌活力。將37°C培養24h的 細菌進行6000rpm離心10min，收集上清液備用;在超凈工作臺內將事先準備好的雞源大腸 桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌進行稀釋1 0-2、1 0-3、1 0-4倍，并分別各吸取1 ΟΟμΙ涂布到LB 瓊脂固體培養基、麥康凱培養基及甘露醇氯化鈉瓊脂培養基中，然后用鑷子將無菌牛津杯 輕輕放置到涂完指示菌株的平皿中，再吸取160-180μ1的益生菌上清液滴到牛津杯內，注意 不要讓上清液溢出牛津杯，最后將平皿放置4 °C冰箱中24h，進行擴散處理。然后放到37°C恒 溫箱中培養24h，觀察抑菌現象。
[0031 ] (5)纖維素降解試驗
[0032]將培養24h的菌株梯度稀釋后接種CMC-Na固體培養基上，每個接種點吸取20μ1菌 液，于37 °C的恒溫箱中培養4d，取出平板后用lmg/ml的剛果紅染色液染色20min，倒掉多余 的剛果紅，分別測量菌落直徑(d)和降解圈的直徑(D)，以降解圈直徑和菌落直徑的比(D/d) 為指標判定菌株降解纖維素的能力。
[0033] (6)耐酸