防治核桃炭疽病的生防菌株及其篩選方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于防治核桃炭疽病的生防菌株技術領域，具體涉及一種防治核桃炭疽病 的真菌生防菌株及其篩選方法與應用。
【背景技術】
[0002] 近些年隨著云南省政府大力發展核桃種植，各地依托當地優勢資源積極發展核桃 產業。該省的核桃生產在全國核桃生產中占有非常重要的地位，其核桃的栽培面積和產量 約占全國的1/3,作為云南省重要的木本油料植物，核桃在改善當地人們生活水平，提高社 會效益方面發揮著重要作用。大理州漾濞彝族自治縣作為云南省五個"全國經濟林核桃之 鄉"之一，其種植核桃具有較為悠久的歷史，核桃產量、品質均居云南省首位。然而，核桃炭 疽病作為近幾年來核桃上的重要真菌病害，嚴重危害著當地核桃產業的健康、有序、快速發 展。據近些年對漾濞核桃產區核桃炭疽病的病害調查結果，嚴重年份該病發生率高達90% 以上，對當地核桃的生產造成較為嚴重的經濟損失。
[0003] 限于生產上對于該病害的防治措施主要依賴于化學藥劑，而病原菌抗藥性逐年顯 現，急需開發適合生產的優良藥劑。目前，學術界對于化學藥劑的替代品生防菌的研究逐年 增加，對生防菌的篩選工作多集中于對農作物、蔬菜等方面的報道上。就核桃炭疽病的生防 菌篩選而言，王清海，牛贍光，劉幸紅，等.核桃炭疽病高效生防菌株鑒定及抑菌活性[J].山 東農業大學學報（自然科學版），2011，（3) :335-337報道了研究發現短芽孢桿菌PF-2對該菌 的抑菌率最高，為88.47%，還有三株均屬于芽孢桿菌屬的細菌也對核桃炭疽病菌具有83% 以上的抑菌率，盡管如此，對于可作為核桃炭疽病的生防真菌的研究尚未見報道。
【發明內容】
[0004] 為解決現有核桃炭疽病防治主要依賴化學藥劑的問題，本發明提出一種防治核桃 炭疽病的生防菌株，該生防菌株為真菌，其對核桃炭疽病菌均有80 %以上的抑菌活性，并且 穩定性好。
[0005] 本發明的技術方案是這樣實現的：
[0006] 一種防治核桃炭疽病的生防菌株，為鉤狀木霉(Trichoderma hamatum)YB-4_15， 保藏單位：中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱:CGMCC，保藏日期:2015-12-07,保藏號：CGMCC No. 11809。
[0007] 進一步，所述生防菌株菌絲對光照條件不敏感，孢子產生需要光照條件。
[0008] 進一步，所述生防菌株菌絲生長的適宜溫度為12-28°c，適宜pH值為4-8。
[0009] 進一步，所述生防菌株生長的培養基為PDA培養基。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種防治核桃炭疽病的生防菌株的篩選方法，包括以 下步驟：
[0011] 1) 土壤微生物分離及指示菌株
[0012] 選擇大理州漾擤縣光明村發病不同的核桃植株根際土壤，|產去表土層，取l〇-15cm 處土樣，采用土壤稀釋平板法進行分離，28°C的恒溫培養箱培養2-3d(天)后，純化長出的菌 株，再將純化菌株放入4°C冰箱保存備用；指示菌株為膠孢炭疽菌（Col letotrichum gloeosporioides)；
[0013] 2)生防菌株篩選
[0014] 初篩:將步驟1)的土壤純化菌株以及指示菌株接種于PDA平板進行活化，采用平板 對峙培養法進行篩選，即將一塊直徑為6mm的指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距 離的圓周上等距離接4塊直徑為6mm 土壤純化菌株，記錄指示菌株直徑，篩選出效果較好的 菌株得到初篩菌株；
[0015] 復篩：一塊指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接2塊 初篩菌株，篩選出對指示菌株抑制作用效果明顯、穩定的生防菌株。
[0016] 本發明的再一個目的是提供一種防治核桃炭疽病的生防菌株在制備防治核桃炭 疽病菌劑方面的應用，將生防菌株接種于含牛肉浸膏的馬鈴薯葡萄糖液體培養基中進行發 酵，將發酵液進行離心，上清液用細菌過濾器過濾，即得無菌濾液菌劑。
[0017] 進一步，所述牛肉浸膏的含量的質量百分數為0.5%。
[0018] 進一步，所述發酵溫度為28°c，所述液體培養基的pH值為7。
[0019] 進一步，所述無菌濾液菌劑抑菌處理溫度為12_45°C。
[0020] 進一步，所述無菌濾液菌劑抑菌處理溫度為28-30 °C。
[0021]本發明的有益效果：
[0022]本發明通過對核桃植株根際土壤進行微生物分離和病原菌對峙培養，分離純化得 到能夠防止核桃炭疽病的生防菌株，該菌株能夠對核桃炭疽病菌均有80%以上的抑菌活 性，同時促進核桃植株的生長。
[0023] 本發明的生防菌劑屬生物制劑，不會對環境和生態造成污染，其有利于核桃的無 公害生產。
【附圖說明】
[0024] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以 根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0025] 圖1為本發明實施例2中生防菌株初篩與復篩結果示意圖；
[0026] 圖2為本發明實施例3生防菌株的菌落形態圖；
[0027] 圖3為本發明實施例3生防菌株的孢子圖；
[0028] 圖4為本發明實施例3生防菌株的產孢瓶體圖；
[0029] 圖5為本發明實施例4生防菌株分子鑒定結果圖；
[0030] 圖6為本發明實施例5不同光照條件對生防菌株的菌絲生長影響的結果圖；
[0031 ]圖7為本發明實施例5不同溫度條件對生防菌株的菌絲生長影響的結果圖；
[0032] 圖8為本發明實施例5生防菌株在不同培養基的生長情況的結果圖；
[0033] 圖9為本發明實施例5不同pH值對生防菌株的菌絲生長影響的結果圖；
[0034] 圖10為本發明實施例7不同濃度的無菌濾液菌劑抑菌效果圖；
[0035] 圖11為本發明實施例8不同溫度不同時間處理無菌濾液菌劑的抑菌效果。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1
[0037] 土壤微生物分離及指示菌株
[0038]選擇大理州漾擤縣光明村發病不同的核桃植株根際土壤，|產去表土層，取10-15cm 處土樣，采用土壤稀釋平板法進行分離，平板為PDA平板，28 °C的恒溫培養箱培養2-3d后，每 處理重復4次，編號，純化生長的菌株，再將純化菌株放入4°C冰箱保存備用；
[0039] 指示菌株為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides)，本實施例中選用西 南林業大學植物病理學實驗室保存的核桃炭疽病菌菌株yb-Ι，該菌株已經在《經濟林研究》 2015年9月第33卷第3期的文獻中報道過，作者為韓長志與霍超，題目名稱為"核桃炭疽病生 防菌yb33的鑒定及其次生代謝物特性分析"。該實驗室已經承諾自該專利申請日起20年內 向公眾發放該生物材料。
[0040] 該PDA培養基的制作參見中國農業出版社1998年出版的方中達著作的植病研究方 法。
[0041 ] 實施例2
[0042]初篩:將實施例1獲得的土壤純化菌株以及指示菌株接種于PDA平板進行活化，采 用平板對峙培養法進行篩選，每處理重復3次，均置于28°C恒溫培養箱進行培養，待對照菌 的菌絲長滿培養皿時，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，觀察并記錄結果；
[0043]即將一塊指示菌株置于roA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接4塊土 壤純化菌株，記錄指示菌株大小，篩選出抑制效果較好的菌株得到初篩菌株;初篩結果顯 示，共有35個菌株的抑菌率在70%以上。
[0044]復篩:一塊指示菌株置于PDA平板中央，在距中央一定距離的圓周上等距離接2塊 初篩菌株，篩選出對病原菌作用效果明顯、穩定的生防菌株。經過復篩發現其中的24個菌株 抑菌率為80%以上。
[0045]兩次篩選共獲得3株抑菌效果均在80%以上的菌株，其編號分別為YB-4-15、YB-8-11-1和YB-7-9-1，上述菌株中，尤以YB-4-15抑菌作用穩定、效果明顯參見圖1與表1。圖1中A 表示初篩結果，圖1中B表示復篩結果。
[0046] 表1經初篩與復篩獲得的土壤拮抗菌株
[0047]
[0048] 實施例3
[0049]將生防菌株YB-4-15進行形態學鑒定
[0050]將生防菌株YB-4-15接種在PDA平板上培養，觀察并記載菌落特征，培養7d后，挑取 菌絲菌落制備玻片，顯微鏡下觀察菌株的微觀形態，并測定其孢子大小，并根據魏景超編 著、中國農業出版社1979出版的真菌鑒定手冊進行鑒定。鑒定結果如下：
[0051 ] PDA培養基上，YB-4-15形成白色菌落，其背面也為白色，無色素，老化后培養基平 板顏色變為淡黃色，有香氣(見圖2);顯微觀察，發現其具有生長稠密的分生孢子堆，可形成 白色皰突，后期分生孢子堆變為淡綠色，后綠色加深，分生孢子梗2.0-3.5μπι，產孢瓶體對 生、輪生或稀疏、不規則著生與孢子梗上，常2-4輪生，少數單生。瓶體一般為燒瓶形，頂端細 長，基部收縮，瓶體直，長(5.0-)6.5-10.0(-12.0)μπι，瓶體中間膨大處2.5-3.5μπι，長寬比為 2.0-4.0(-5.5)，基部寬為1.5-2.5μπι ;分生孢子綠色，細橢球形，大小為3.0-5.5 X 2.5-3.5μ m，長寬比為1.1-1.8,壁光滑(見圖3與圖4)。通過上述形態學觀察，根據真菌鑒定手冊，初步 將該菌鑒定為康氏木霉(Trichoderma koningii 0ud)〇
[0052] 實施例4
[0053] 生防菌株YB-4-15ITS序列測定
[0054] 1)ΥΒ-4-15 基因組 DNA 制備
[0055] 將純化的菌絲塊（1 cm X 1 cm)于新鮮的PDA液體培養基中黑暗、28 °C恒溫培養箱培 養3d，采用CTAB法提取該菌株的基因組DNA。
[0056] 2)rDNA-ITS區PCR擴增與序列測定
[0057] 采用真菌核糖體rDNA區通用引物擴增ITS1-5.8S rDNA-ITS2片斷PCR，測序獲得了 生防菌株YB-4-15的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列，見序列表SEQ ID N0:3。擴增引物序列為：
[0058] ITS1:5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，見SEQ ID NO: 1 所示；
[0059] itsls'-tcctccgcttattga