阻斷人程序性死亡因子1(pd-1)功能的單克隆抗體及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥技術領域，尤其涉及抗人PD-1單克隆抗體的制備及可變區序 列及應用。
【背景技術】
[0002] 程序性死亡因子l(programmed cell death 1，PD-1)是在活化T細胞和B細胞表面 上表達的免疫抑制性受體（Yao，Zhu et al.Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation.Nat Rev Drug Discov,2013,12(2)： 130-146)。最初發現時，因其結構類似于⑶28分子，PD-1被認可是⑶28超家族成員。然而H)-1蛋白因缺乏介導CD28/CTLA-4與B7.1/B7.2相結合的MYPPPY序列，以及介導IC0S與IC0S-L 相結合的roPPPF序列，因而在結構上與CD28、CTLA-4及IC0S存在明顯差異。因此，PD-1與配 體的結合非常特異，不與其他的B7家族分子產生交叉結合。
[0003] PD-1 有兩個配體：PD-L1 和 PD-I^JD-Ll 又稱 B7H1 或 CD274，PD-L2 稱為 B7DC 或 ⑶273JD-1主要表達于⑶4+T細胞、CD8+T細胞、NKT細胞、B細胞和活化的單核細胞表面，主 要受T細胞受體(TCR)或B細胞受體(BCR)信號的誘導表達，TNF可增強PD-1在這些細胞表面 的表達（Francisco, Sage et a 1 . , The PD- 1 pathway in tolerance and autoimmunity · Immunol Rev，2010，236:219-242) ePD-Ll和]^-1^2表達于不同的細胞群體 (Shimauchi，Kabashima et al.,Augmented expression of programmed death-1 in both neoplastic and non-neoplastic CD4+T_cells in adult T-ce11 leukemia/ lymphoma · Int J Cancer，2007，121 (12): 2585-2590)，大量的研究表明，PD-L1 與活化的T細 胞上的ro-i相互作用可顯著抑制效應性τ細胞的生物學功能，PD-1、ro-Li或ro-L2的表達改 變導致ro-1/PD-L抑制途徑發生異常，進而機體發生免疫功能亢進/低下性疾病，PD-1基因 敲除小鼠可引發多種自身免疫性疾病。
[0004] 研究表明，PD-1信號通路也參與病毒性及微生物感染性疾病的進程。多種慢性和 急性病毒也通過ro-ι和ro-Li信號逃避人體免疫監測。例如:HIV感染者體內PD-1的表達水 平與T細胞的耗竭程度密切相關，且可作為AIDS病情進展的標志之一（Trabattoni， Saresella et al.，B7_Hlis up-regulated in HIV infection and is a novel surrogate marker of disease。1'〇8代88；[011.13100(1，2003，101(7):2514-2520)。此現象也 同樣適用慢性乙月干患者(Evans ,Riva et al ·，Programmed deathlexpressionduring antiviral treatment of chronic hepatitis B：Impact of hepatitis B-antigen seroconversion ·，Hepatology，2008，48(3): 759-769)。動物實驗顯不，PD_1基因剔除小鼠 比正常小鼠更好地控制病毒感染;而將HBV特異型T細胞轉移到HBV轉基因動物中會引發肝 炎。實驗證實阻斷ro-i信號有可能應用于HIV等病毒感染的臨床治療。
[0005] PD-1和PD-L1相互作用以調節控制T細胞的活化在腫瘤和病毒感染中得到了大量 驗證。PD-L1表達于多種腫瘤細胞表面，這些腫瘤細胞包括:肺癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，皮 膚癌，膀胱癌，結腸癌，乳腺癌，神經膠質瘤，腎癌，胃癌，食道癌，口腔鱗狀細胞癌，頭頸癌。 而且在這些癌癥周邊也發現了大量表達ro-Ll的⑶8+T細胞。臨床統計顯示，PD-L1在腫瘤細 胞上的高表達水平與癌癥患者不良預后相關(Okazaki和Hon jo 2007，同上）JD-1和PD-L1 之間的相互作用導致滲入腫瘤的淋巴細胞減少、T細胞受體介導的增殖減少、及癌性細胞的 免疫逃避（Dong等人（2003 )J. Mol .Med .81 :281-7 ; Blank等人（20 05) Cancer Immunol · Immunother. 54:307-314 ;Konishi等人（2004)Clin · Cancer Res · 10:5094-100) 〇 研究發現通過抑制ro-i與ro-Li的局部相互作可逆轉免疫抑制，而且當ro-i與PD-L2的相互 作用也被阻斷時具有累加效果（Iwai等人（2002)Proc.Nat'L·AcacL Sci.USA99:12293-7; Brown等人（2003) J. Immunol. 170 ： 1257-66) 〇
[0006] 綜上所述，通過特異性阻斷ro-1 /PD-L抑制信號可以使機體中失能的效應性細胞 恢復生物學功能，促進腫瘤和病毒特異性CD8+T細胞的活化增殖與細胞因子的分泌，增強淋 巴細胞對腫瘤抗原、外來入侵的病毒等的殺傷力，提高機體免疫力，及時清除腫瘤細胞和病 毒。因此，PD-1/ro-L有望成為腫瘤免疫治療的有效靶分子，也為HIV等慢性病毒感染性疾病 及自身免疫性疾病的治療提供一個新的策略。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供對hPD-Ι(人PD-1)有很高親和力的抗體，抗體名稱為43-H-8。該抗體能阻斷hPD-Ι受體與其配體B7-H1結合，可以應用于治療抗腫瘤、抗感染及自身免 疫性疾病等治療藥物中。
[0008] 本發明提供1株穩定表達抗體蛋白的雜交瘤細胞株，并保藏在武漢大學中國典型 培養物保藏中心。保藏單位地址為湖北省武漢市武昌區八一路299號武漢大學校內，武漢大 學保藏中心。保藏日期為2015年9月28日，保藏編號為CCTCC C2015153。暫無分類命名。
[0009] 本發明提供一種分離的DNA.分子，編碼所述抗hPD-Ι人源抗體的重鏈和或輕鏈的 可變區或全長氨基酸。
[0010]抗體重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO: 1的第58位至1407位所示的核苷酸序 列；其抗體輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID N0:2的第58位至1407位所示的核苷酸序列。 [0011]抗體重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID N0:3或其保守型變異序列；其抗體輕鏈 可變區的氨基酸序列為SEQID N0:4或其保守型變異序列。
[0012] SEQ ID NO. 1和2第1位至57位堿基序列是編碼信號肽序列的核苷酸序列。
[0013] SEQ ID N0.3和4第1位至19位氨基酸序列是信號肽序列。
[0014]所述抗hPD-1單克隆抗體可以是抗體的全長序列，也可以是抗ro-1抗體的片段，上 述蛋白和抗體包括:重組蛋白，重組抗體、ScFv抗體、人源化抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、 單域抗體以及ADC偶聯抗體和蛋白。
[0015] 所述抗體也可以進一步提供所述抗hPD-ι抗體的衍生物，所述衍生物為hPD-ι抗體 的片段、抗體/抗體片段-因子融合蛋白、抗體/抗體片段-化學偶聯物。
[0016] 本發明新發現了 1種對hPD-ι有顯著高親和力的單克隆抗體43-H-8。這種單克隆抗 體不僅能夠與hPD-Ι抗原特異性結合，半數有效濃度與參照品相近，并且能阻斷hPD-Ι與其 配體結合的能力。
[0017] 本發明從單克隆細胞株中獲取目的抗體的基因序列，可用以構建真核表達載體， 表達后即可重建抗體的活性，獲得抗hPD-1單克隆抗體。
[0018] 本發明所述的抗hPD-Ι單克隆抗體可用來制備抗腫瘤(包括高表達hPD-Ι的肺癌、 肝癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌、卵巢癌、結直腸癌、胃癌、胃腸道間質瘤、膀胱癌、甲狀腺癌、黑色 素瘤、頸癌、前列腺癌)藥物、抗感染(感染性疾病包括HIV、HBV、HCV等病毒感染引起的疾病） 藥物及用來制備自身免疫性疾病(包括系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、系統性脈管炎、 銀肩病、多發性硬化癥、潰瘍性結腸炎)治療的藥物，其制備方法是以抗PD-1單克隆抗體為 主要成分，加上制藥學上可接受的輔料和/或添加劑，經過凍干處理，制備成藥學上可接受 的藥劑。
[0019] 本發明的優點在于該抗體對hPD-Ι有很高的親和力。在動物細胞中高效表達，可用 于工業化生產。實驗證明，本發明的抗hPD-Ι單克隆抗體能阻斷hPD-Ι受體與其配體B7-H1結 合。
[0020] 所以，本發明所述抗體對腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的治療具有廣泛的 應用前景。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為抗ro-i抗體的親和力能力實驗。
[0022] 圖2為抗ro-i抗體的阻斷試驗
【具體實施方式】
[0023] 以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本發明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案
[0024] 實施例1
[0025] hro-i的穩定膜表達
[0026]為了得