一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及多肽藥物領域，具體涉及一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應用，尤 其一種作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的芋螺毒素多肽。
【背景技術】
[0002] 肌肉煙堿型乙酰膽堿受體存在于神經肌肉接頭處突觸后膜，由5個亞單位組成，在 胎兒肌肉為α2βγδ，在成人肌肉為α2βεδ。當神經沖動傳導至運動終，突觸前膜釋放乙酰膽 堿，乙酰膽堿作用在突觸后膜乙酰膽堿受體的α亞單位，開啟離子通道，引起肌肉收縮。
[0003] 現在在美容界廣泛使用的Β0Τ0Χ(保妥適），即注射用Α型肉毒毒素，其作用機理正 是阻斷神經末梢分泌能使肌肉收縮的乙酰膽堿，從而達到麻痹肌肉的效果。由于麻痹了肌 肉使得肌肉沒有跳動能力而消除了皺紋，適用于暫時改善65歲及65歲以下成人因皺眉肌/ 或降眉間肌活動引起的中度至重度皺眉紋。然而肉毒桿菌毒素是由肉毒桿菌在繁殖過程中 所產生的一種神經毒素蛋白，價格較高。而且注射肉毒桿菌毒素有明顯的副作用，會產生頭 痛、過敏、復視、表情不自然的不良反應，因此不適合廣泛使用。
[0004] 抗皺蛇毒SYN-AKE是由瑞士 DSM荷蘭皇家帝斯曼集團全資子公司PENTAPHARM通過 高科技生化科技，模擬Temple Viper毒蛇的血清中含有的Waglerinl蛋白，合成的三肽衍生 物。SYN-AKE為肌肉煙堿乙酰膽堿受體(nmAChR)拮抗劑，專門作用于肌肉煙堿乙醯膽堿突出 膜，通過競爭性結合乙酰膽堿受體亞基，阻斷乙酰膽堿與通道的結合，以達到抑制神經肌肉 收縮之作用，在除皺方面有特效。但是相比肉毒桿菌SYN-AKE更安全有效。
[0005] 芋螺毒素（conotoxin或conopeptide，或CTX)，由海洋腹足綱軟體動物芋螺 (Conus)的毒液管和毒囊內壁的毒腺所分泌，由許多單一毒肽組成的雞尾酒樣的混合毒素， 主要成分是一些對不同離子通道及神經受體高專一性的活性多肽化合物。它們能特異性地 作用于乙酰膽堿受體及其他神經遞質的各種受體亞型，以及鈣、鈉、鉀等多種離子通道。芋 螺毒素與蛇毒的作用機理基本一致，而芋螺毒素相對分子質量更小、結構更穩定、作用效果 更強、更易于合成。因而芋螺毒素在開發為抗皺產品方面更有優勢。
【發明內容】
[0006] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應用。本發 明所述芋螺毒素多肽能夠作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，且分子量更小、結構更穩定、作 用效果更強、更易于合成。
[0007] 為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0008] -種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0009] 本發明還提供了在ΗΡΑ的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基 所得到的氨基酸序列的多肽。
[0010]本發明也提供了編碼本發明所述多肽的DNA分子。
[0011]本發明還提供了所述芋螺毒素多肽的制備方法，包括以下步驟：
[0012] 1)固相合成ΗΡΑ-氨基樹脂；
[0013] 2)ΗΡΑ-氨基樹脂裂解得到ΗΡΑ粗肽；
[0014] 3)ΗΡΑ粗肽用1%醋酸溶液溶解后，凝膠柱層析分離，反相高效液相色譜法純化得 到ΗΡΑ精肽。
[0015] 優選的，所述固相合成為Fmoc-Arg(Pbf )-0Η和氨基樹脂反應合成Fmoc-Arg(Pbf)-氨基樹脂，然后采用逐一偶聯的方式偶聯Fmoc保護基團的其他氨基酸得到ΗΡΑ-氨基樹脂。 [0016]其中，所述氨基樹脂優選為Rink Amide樹脂。
[0017] 本發明所述制備方法步驟2)所述裂解的裂解劑為氟乙酸、三異丙基硅烷與苯酚的 混合物。
[0018] 優選的，所述三氟乙酸、三異丙基硅烷與苯酚的體積比為95:2.5:2.5。
[0019]本發明利用膜片鉗技術對上述篩選出的多肽進行檢測，結果顯示多肽ΗΡΑ能夠作 用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體。因此，本發明提供了所述多肽 ΗΡΑ作為肌肉煙堿乙酰膽堿受體拮抗劑的應用。
[0020] 進一步的，本發明還提供了所述多肽ΗΡΑ在制備抗皺化妝品中的應用。
[0021] 由上述技術方案可知，本發明提供了一種芋螺毒素多肽及其制備方法與應用。本 發明所述芋螺毒素多肽其氨基酸序列為ΗΡΑ。實驗結果表明本發明所述芋螺毒素多肽ΗΡΑ能 夠作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體，可作為肌肉煙堿乙酰膽堿 受體拮抗劑。本發明所述芋螺毒素多肽ΗΡΑ可以用于制備抗皺化妝品，應用范圍廣泛，具有 良好的經濟和社會效應。
【附圖說明】
[0022] 為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0023] 圖1示實施例2ΗΡΑ成品質譜圖；
[0024] 圖2示實施例2ΗΡΑ成品高效液相色譜圖；
[0025]圖3示實施例4對比于陽性藥物，ΗΡΑ對于乙酰膽堿引起的電流的抑制圖，其中圖A 為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖B為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι陽性藥物引起的 電流，圖C為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖D為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι ΗΡΑ引 起的電流；
[0026] 圖4示實施例4ΝΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN對于乙酰膽堿引起電流的作用圖，其中圖A、 C、E、G均為加入ΙΟμπι乙酰膽堿引起的電流，圖B為加入1 Ομπι乙酰膽堿后再加入1 Ομπι NPA引起 的電流，圖D為加入1 ΟμL?乙酰膽堿后再加入1 ΟμL? 了 WNPA引起的電流，圖F為加入1 ΟμL?乙酰膽 堿后再加入ΙΟμπι GKYYS引起的電流，圖Η為加入ΙΟμπι乙酰膽堿后再加入ΙΟμπι GKHFN引起的 電流；
[0027]圖5示實施例5對于乙酰膽堿引起的電流，ΗΡΑ的濃度效果曲線圖。
【具體實施方式】
[0028]下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發明保護的范圍。
[0029] 為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0030] -種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0031] 現在已知的作用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的α-芋螺毒素多為10-20個氨基酸的 多肽，本發明通過生物信息學方法，篩選α3/5芋螺毒素半胱氨酸環內小肽的序列在NCBI中 的blastp中進行同源序列比對，對于有相同序列的蛋白和國際化妝品原料表(INCI)-一匹 配，將兩者均能匹配上序列作為候選的小肽。篩選出NPA，ΗΡΑ、WNPA、GKYYS、GKHFN。
[0032]人乙酰膽堿受體主要來源于臨床外科斷肢肌肉和表達人乙酰膽堿受體的人橫紋 肌肉瘤細胞ΤΕ 671細胞株。而膜片鉗技術則可以對電極尖端下面積僅為幾平方微米的細胞 膜片上一個或幾個離子通道的電流進行記錄，從而檢測是否產生可引起肌肉收縮的動作電 位。因此，本發明利用膜片鉗技術對上述篩選出的多肽進行檢測，結果顯示多肽ΗΡΑ能夠作 用于肌肉煙堿型乙酰膽堿受體，有效的抑制乙酰膽堿受體。
[0033] 因此，本發明提供了一種芋螺毒素多肽，其氨基酸序列為ΗΡΑ。
[0034] 本發明還提供了在ΗΡΑ的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基 所得到的氨基酸序列的多肽。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位 點進行