基于nbdk的定點熒光標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于NBDK的定點熒光標記方法。
【背景技術】
[0002] 蛋白質熒光標記是一種用于研究蛋白質結構和功能的重要手段。目前已有的熒光 標記技術大致包括以下幾種：（1)熒光蛋白廣泛應用于蛋白質的標記，例如紅色熒光蛋白 Green Fluorescent Protein(GFP)是一種通過融合表達進行蛋白質標記方法，然而焚光蛋 白只能通過融合表達的方法標記在蛋白質的氮(N)端或碳(C)端，無法在蛋白質氨基酸其他 序列中實現標記;且由于GFP體積較大，會對蛋白質結構和功能造成影響，其應用范圍有限。 鑒于熒光蛋白質在蛋白質標記上的缺點，近年來基因編碼NBDK和NBD-酪氨酸的技術得以發 展，利用NBD-酪氨酸或NBDK的定點插入，可克服熒光蛋白的缺點。然而這兩種氨基酸只能用 488nm的激發光進行激發，發射波長在510-550nm的綠光，相比熒光蛋白標記方法，熒光氨基 酸發射的熒光尚單一，急需擴展。NBDK可被560nm的激發光激發，在600-640納米發射，彌補 了NBDK類氨基酸的無法在偏紅外波長發射熒光的不足。吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶可以 在細菌和真核細胞中實現穿梭，廣泛應用于識別非天然氨基酸的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合 成酶的篩選。
[0003] 基于此，有必要設計一種基于NBDK的定點熒光標記方法能夠在真核生物(哺乳動 物細胞)中實現目的蛋白的紅色熒光標記。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種基于NBDK的定點熒光標記方法，所述基于NBDK的定點 熒光標記方法能夠在真核生物(哺乳動物細胞）中實現目的蛋白質的氨基酸序列的任意位 點的熒光標記，旨在解決目前熒光標記方法無法實現真核生物蛋白的紅色熒光標記。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供一種基于NBDK的定點熒光標記方法，所述基于NBDK 的定點熒光標記方法包括如下步驟：
[0006] 51:獲得183冰64?711?突變庫；
[0007] S2:獲得 NBDK;
[0008] S3:篩選特異識別NBDK的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶(NBDKRS)突變體(NBDKRS);
[0009] S4:在鯨魚肌紅蛋白Myoglobin-4TAG中插入NBDK，驗證篩選得到的NBDKRS能夠實 現目的蛋白質在偏紅外熒光標記插入。
[0010]優選地，所述步驟S1包括如下步驟：
[0011] 511:人工合成18&吐64?711?的0嫩序列；
[0012] S12:將上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列連接到pBK質粒上，獲得重組質粒 A；
[0013 ] S13:設計定點突變引物，所述定點突變引物包括引物、引物引物f-260NNk和引物 r-L260NNk、引物f-L270NNK和引物r-L270NNK、引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK、 引物f-W382NNK和引物 r-W382NNK;
[0014] S14:以所述重組質粒A為模板，以所述引物f-260NNk和引物r-L260NNk為引物，通 過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫1;
[0015] S15:以所述突變庫1為模板，以所述引物f-L270NNk和引物r-L270NNk為引物，通過 聚合酶鏈式反應，獲得突變庫2;
[0016] S16:以所述突變庫2為模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK為 引物，通過聚合酶鏈式反應，獲得突變庫3;
[0017] S17:以所述突變庫3為模板，以所述引物f-W382NNk和引物r-W382NNk為引物，通過 聚合酶鏈式反應，獲得突變庫4;
[0018] S18 :所述突變庫1、突變庫2、突變庫3和突變庫4按照預定的比例混合，獲得用于 NBDK篩選用的M.Barkeri PylRS突變庫。
[0019]優選地，所述預定的比例為1:1:32:1。
[0020] 優選地，所述步驟S2包括如下步驟：
[0021] S21:取預設量的4-氯-7-硝基苯-2-氧-1,3-二唑(NBD-C1)和賴氨酸，溶于乙酸乙 酯和水中，并加熱到30°C，滴加預設量的十六烷基三甲基溴化胺，反應2小時后即可得到 NBDK1；
[0022] S22:取預設量的NBDK1經液相色譜分離，濾膜過濾除菌，得到NBDK2。
[0023] 優選地，所述NBDK2經過0.22微米濾膜過濾除菌，獲得NBDK母液C。
[0024] 優選地，所述NBDK母液C的濃度設定為1 OOmM。
[0025] 優選地，所述步驟S3包括如下步驟：
[0026] S31:構建和轉化用于正篩選作用的pylT-pREP質粒；
[0027] S32:構建用于表達驗證的pylT-pBAD質粒，進行轉化和篩選，獲得能夠特異識別 NBDK的氨酰-tRNA合成酶NBDKRS的菌株。
[0028] 優選地，所述 NBDKRS 的突變位點為 L260G，L270A，N311A，N313G，W382C。
[0029] 優選地，所述S4包括如下步驟：
[0030] S41:共轉化 NBDKRS-pBK 和 Myoglobin-4tag-pBAD 至 T0P10 中；
[0031 ] S42:獲得純化的Myoglobin蛋白質；
[0032] S43:將上述S42中獲得Myoglobin蛋白質在550nm激光激發下，發出焚光，即可驗證 篩選得到的NBDKRS能夠實現目的蛋白的紅色熒光標記。
[0033]本發明提供的基于NBDK的定點熒光標記方法通過合成M. Barker i物種的吡咯賴氨 酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并將所述DNA序列連接到pBK質粒上;通過采用"飽 和突變"的方法，構建了能夠在原核和真核生物細胞中表達的M.Barkeri物種的吡咯賴氨酸 氨酰-tRNA合成酶突變庫Lib-NBDKRS;通過合成用于定點熒光標記的NBDK，進行篩選和驗 證，達到了基于NBDK在真核生物(哺乳動物細胞）中實現目的蛋白的紅色熒光標記。
【附圖說明】
[0034]圖1為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的流程示意圖；
[0035]圖2為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的步驟S1的流程示意圖；
[0036]圖3為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的步驟S2的流程示意圖；
[0037]圖4為本發明NBDK的結構示意圖；
[0038]圖5為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的步驟S3的流程示意圖；
[0039]圖6為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的步驟S4的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0040]下面結合具體實施例對本發明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發明的解 釋，本發明并不局限于以下實施例。
[0041] 本發明提供的基于NBDK的定點熒光標記方法，所述基于NBDK的定點熒光標記方法 是通過檢測真核生物鯨魚肌紅蛋白插入了 NBDK，所述鯨魚肌紅蛋白在560nm激光激發下，發 出熒光來實現的。
[0042] 在本實施例中，M.Barkeri表不一種產甲燒厭氧菌；PylRS(pyrrolysine aminoacyl-tRNA synthetase)中文為吡略賴氨酸氨酰-tRNA合成酶。
[0043] 在實施例中，如圖1所示，圖1為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的流程示意 圖。野生型產甲烷厭氧菌的PylRS(吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶）只識別吡咯賴氨酸(第22 種基因編碼的天然氨基酸），并催化吡咯賴氨酸和對應的tRNA發生轉運反應，從而把吡咯賴 氨酸連接到對應tRNA上，延伸因子EF-Tu攜帶上述產物至核糖體，參與蛋白質合成。tRNA又 稱轉運RNA(transfer ribonucleic acid tRNA)，是具有攜帶并轉運氨基酸功能的一類小 分子核糖核酸。但是野生型的產甲烷厭氧菌的PylRS(吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶)并不識 別NBDK，NBDK的中文全稱為7-硝基苯并-2-氧雜-1，3-二唑-賴氨酸；因此并不能確定哪一種 PylRS突變體能夠識別NBDK，所以要做突變-建庫-篩選(定向進化），最終篩選到能夠特異識 別NBDK的PylRS突變體，即命名為NBDKRS。
[0044]在本實施例中，如圖2所示，圖2為本發明基于NBDK的定點熒光標記方法的步驟S1 的流程示意圖。步驟S1為獲得M.Barkeri PylRS突變庫;在實現步驟S1的過程中，又可分8個 步驟來實現：
[0045] 511:人工合成]\1.1^冰61^?711?3的0嫩序列；
[0046] S12:將上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA連接到pBK質粒上，獲得重組質粒A;
[0047] S13:設計定點突變引物，所述定點突變引物包括引物、引物引物f_260NNk和引物 r-L260NNk、引物f-L270NNK和引物