1-磺酰胺基-4-芳氧基類化合物、制備方法及其醫藥用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物化學領域，具體涉及一類具有抗炎活性以1-磺酰胺基-4-芳氧基 類為基本骨架的化合物，包括這些化合物制備方法以及在抗炎領域的應用。
【背景技術】
[0002] 目前普遍使用的抗炎治療藥物主要分為留體類抗炎藥，主要是皮質激素類和非甾 體抗炎藥主要是環加氧酶抑制劑。非留體抗炎藥的化學結構雖然各不相同，但大多通過抑 制前列腺素的合成，發揮其解熱、鎮痛、消炎作用。目前臨床使用的這些抗炎藥物均是通過 抑制炎癥反應而產生抗炎藥效，并不能或是很少能改善形成炎癥的病因。要從根本上是治 療炎癥需要改善形成炎癥的微環境并激活體內的抗炎系統。炎癥反應和氧化應激具有重要 的內在關聯性。氧化應激可以導致蛋白、核酸和脂類分子損傷，從而引起炎性損傷，激活炎 癥因子、誘發和加劇炎癥反應，這種炎癥與腫瘤，心血管疾病、帕金森、阿爾茲海默癥、慢性 腎病等疾病的發生和發展密切相關;而抗氧應激相關的蛋白可以清除活性氧、加速異物代 謝并升高體內抗氧化蛋白含量從而改善炎性微環境而治療炎癥（Trends Biochem Sci 2009；34(4):176-188；Annu Rev Pharmacol Toxicol 2007；47:89-116；J Biochem Mol Biol 2004;37(2):139-143;Genes Cells 2011;16(2):123-140)〇
[0003] Nrf2是1994年首次在血紅素誘導的紅系K562細胞中被鑒定出來，參與調控氧化應 激的關鍵轉錄因子。Nrf2屬于亮氨酸拉鏈核轉錄因子家族，和果繩CNC(Cap n'Collar)家族 同源，人類Nrf2和核因子紅系2亞單位p45高度同源。氧化應激相關的大部分抗氧化基因都 包括抗氧化反應元件(ARE)，Nrf2通過結合ARE而發揮轉錄起始活性。ARE的共同序列為5'-RTGAYnnnGCR-3'（其中R = A or G，Y = C or ThKeapl是細胞內Nrf2的主要負調控蛋白，其 主要功能是在正常情況下保持細胞內較低的Nrf2水平;在應激狀態下解除對Nrf2的負調控 作用，升高Nrf 2的水平。通過抑制Keap 1對Nrf 2的負調控作用可有效升高Nrf 2水平，激活體 內抗氧化系統，減輕炎性損傷，改善炎癥微環境，從而達到從根本上緩解和治療炎癥的作 用。
[0004] 目前，Nrf2激活劑已經被用于治療炎性相關疾病。如富馬酸二甲酯已經被FDA批準 用于治療多發性硬化癥，CDDO-Me正在開展治療肺動脈高壓(PAH)的二期臨床。另外一些具 有抗炎活性的天然產物和類天然產物也已經被證實可激活Nrf2。例如姜黃素、白藜蘆醇和 查爾酮等。
[0005] 這些Nrf2激活劑多具有能和Keapl巰基結合的多不飽和結構，被認為是共價修飾 型的Nrf2激活劑。而最近已有文獻報道，競爭性干擾Keapl-Nrf2相互作用亦可有效解除 Keapl對Nrf2的負調控作用而激活Nrf2。此種激活Nrf2的方式具有競爭性、特異性、可逆性 和高選擇性的特點，避免了共價修飾激活Nrf 2的潛在毒性問題，是當前研究Nrf 2激活型炎 性疾病治療藥物的熱點。
【發明內容】
[0006] 本發明公開一種含醚鍵和單磺酰胺結構的化合物，其制備方法及其醫療用途。初 步的活性測試證明本發明化合物具有良好的干擾Keapl-Nrf 2的結合，從而激活Nrf 2，具有 潛在的抗炎活性，可以用于治療眾多炎癥相關疾病包括慢性阻塞性肺疾病(C0PD)阿爾茨海 默癥、帕金森、動脈粥樣硬化、慢性腎臟疾病(CKD)、糖尿病、腸部炎癥、類風濕性關節炎等。
[0007] 本發明的化合物結構式（I)如下：
[0008]
[0009] 其中Ri代表4-三氟甲基、4-三氟甲氧基、4-硝基、4-羥基、4-羥甲基、4-氰基或4-氨 基;單、雙或三取代H、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷氨基或C1-C3酰氨基；
[0010] R2代表4-三氟甲基、4-三氟甲氧基、4-硝基、4-羥基、4-羥甲基、4-氰基、4-氨基、4-嗎啉甲氧基、4-芐基甲氧基或4-芐基乙氧基;單、雙或三取代H、鹵素、C1-C3烷基、C1-C3烷氧 基、C1-C3烷氨基或C1-C3酰氨基；
[0011] R3 代表 H、-CH2C00H、
[0012] n = 0-3〇
[0013] 心優選代表4-甲氧基、4-溴、4-氯、4-氟、2，4，6-三甲基、4-叔丁基、2，4，6-三甲氧 基、4-甲基、3,4_二甲氧基、4-乙酰氨基或4-三氟甲基。
[0014] 辦優選代表4-甲氧基、4-乙氧基、4-異丙氧基、4-氟、4-氯、4-溴、4-乙酰胺基、4-三 氟甲基、4-羥基、4-嗎啉甲氧基、4-嗎啉乙氧基、4-氨基或4-芐胺基。
[0015] R3 優選代表-CH2C00H 或
[0016] η優選代表0或1。
[0017] 其中藥學上可接受的鹽是優選通式(I)化合物的羧酸鈉鹽、羧酸鉀鹽或羧酸鈣鹽。
[0018] 本發明還公開了通式（I)化合物的制備方法，當R3為CH2⑶0Η、Η、4_η時，優選 的制備方法如下：
[0019]
[0020] 其中Ri、R2、n的定義同前。
[0021] 化合物（1)到化合物(2)的合成步驟中，采用氫氣鈀碳還原，所采用的溶劑優選甲 醇和四氫呋喃，鈀碳投料量優選化合物(2)到化合物(3)的合成步驟中，化合物(2) 與反應物(Boc) 20物質的量比優選1:1.5~1: 2。
[0022]化合物（3)到化合物(4)的合成步驟中，所采用的堿優選碳酸氫鉀、碳酸鉀、碳酸 銫、碳酸鈉、碳酸氫鈉，溶劑優選二甲亞砜，N，N-二甲基甲酰胺、1，4_二氧六環、乙腈中的一 種或幾種。
[0023]化合物(4)到化合物（5)的合成步驟中，溶劑體系優選HC1 /CH2C12溶液、CF3C00H/ CH2Cl2〇
[0024] 化合物（5)到化合物(6)的合成步驟中，所采用的堿優選碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸 鈉、碳酸氫鈉、吡啶、三乙胺，優選在以下溶劑中進行反應:四氫呋喃、二氯甲烷、1，4_二氧六 環。
[0025] 化合物(6)到化合物(7)，化合物(6)與溴乙酸甲酯的重量比優選1:2~1:3，所采用 的堿優選碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、吡啶、三乙胺，優選在以下溶劑中進行反應： 二甲亞砜，N，N-二甲基甲酰胺、1，4_二氧六環、乙腈。反應溫度在室溫即可。
[0026] 化合物（7)到化合物（8)，氫氧化鋰投料量優選，使氫氧化鋰在溶液中濃度為1-3mol/L，其溶劑體系為甲醇/水體系或乙醇/水體系，反應室溫即可。
[0027] 化合物（6)到化合物（9)氫氧化鋰投料量優選，使氫氧化鋰在溶液中濃度為1-3mol/L，其溶劑體系為甲醇/水體系或乙醇/水體系，反應室溫即可。
[0028] 化合物（7)到化合物（10)，氫氧化鋰投料量優選，使氫氧化鋰在溶液中濃度為1-3mol/L，其溶劑體系為甲醇/水體系或乙醇/水體系，反應室溫即可。 rV
[0029] 當R3為時，制備方法優選如下： I N hn、m
[0030]
[0031] 其中Ri、R2、n的定義同前。
[0032] 化合物1至化合物6的合成方法與當通式（I)中R3為CH2C00H、H時相同。
[0033]化合物6至化合物11，所采用的堿優選碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉，優選 在以下溶劑中進行反應:二甲亞砜，N，N_二甲基甲酰胺、1，4_二氧六環、乙腈，原料6與溴乙 腈的投料比（物質的量比）為1:1-1:4,反應溫度在室溫即可。
[0034]化合物11至化合物12，氯化銨投料量(物質的量比）1:4-1:8，，優選在一下溶劑中 進行反應:N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環，一種或幾種，加熱至回流反應。
[0035]化合物12至目標化合物（13)，氫氧化鋰投料量優選，使氫氧化鋰在溶液中濃度為 l-3mol/L，其溶劑體系為甲醇/水體系或乙醇/水體系，反應室溫即可。
[0036]優選下列化合物：
LUUJV」 卜囬約埋頭驗甲涉及的化甘物代虧等冋t此處代虧所對吆的化甘物。
[0040]本發明基于Nrf2-Keapl蛋白-蛋白相互作用，發現了結構新穎、具有較好的理化性 質的活性小分子，該小分子在基于熒光偏振的Keapl-Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制實驗中， 表現出的活性明顯優于公認的陽性對照，一段具有9個氨基酸的Nrf 2(Ac-LDEETGEFL-OH)多 肽。在熒光素酶報告基因試驗中，該小分子表現出優于陽性對照tBHQ(特丁基對苯二酚）的 誘導活性，有望進一步開發為抗炎藥物。
[0041]下面是本發明的部分代表化合物的藥理試驗及結果：
[0042] 1.基于熒光偏振的Keapl_Nrf2蛋白-蛋白相互作用抑制實驗(FP實驗）
[0043] FP實驗所使用的儀器是SpectraMax Multi-Mode Microplate Reader(Molecular Devices)，根據相應熒光基團選擇儀器的激發光和發射光的波長。使用Corning 3676 384 孔板進行實驗工作。孔板的反應體系為40yL。其中包含10yL的4nM FITC-9mer Nrf2多肽熒 光探針，10yL的12nM Keap 1 Ke 1 ch結構域蛋白溶液和20yL相應濃度的抑制劑。陽性對照采 用20yL 100nM CPUY192002+10yL探針+10yL蛋白溶液，陰性對照為10yL探針+10yL蛋白溶液 +20yL HEPES緩沖液，空白對照為10yL探針+30yL HEPES緩沖液。在測試前預先在室溫下混 勻、孵育30分鐘。本實驗中探針熒光基團為熒光素，其激發光波長為485nm，發射光波長為 535nm。本研究中使用水平方向和垂直方向的熒光強度(F| |和Fi)計算毫偏值(mP)反應偏 振光的變化情況。
[0044] 抑制劑在某濃度下的抑制率計算方法為
[0045] 抑制率％ = (1-(Ρ--ΡΜη)/(Ρ·χ-ΡΜη)) X 100。
[0046] 該方程中的Pmax、Pmin和P-分別代表Keapl和熒光探針孔的偏振值、熒光探針孔的 偏振值以及含有抑制劑孔的偏振值。使用抑制劑的濃度-抑制率曲線計算化合物的I C5〇.
[0047]
[0048]
[0049] 從上表可以看出，化合物1-14，15，16表現出優于陽性對照，一段含有9個氨基酸的 Nrf2多肽。
[0050] 2、ARE熒光素酶報告基因實驗
[0051] 體外細胞培養
[0052]將轉染含有ARE熒光素酶報告基因質粒的HepG2細胞（使用自QIAGEN購買的 Antioxidant Response Reporter質粒，根據所給指南進行轉染得到）用含有10%胎牛血清 的RPMI-1640培養基，于37°C、5 % C02條件下培養。
[0053] (1)將處于對數生長期的!1叩6241^-08細胞用0.25%胰酶消化液處理，制成濃度 為4X105的細胞懸液。分別向96孔酶標板中加入100yL培養過夜。
[0054] (2)將待測化合物用培養基配置成2倍于所需濃度，分別向對應的孔中加入100yL， 其tBHQ為陽性對照，DMSO為陰性對照。將加好化合物的96孔酶標板至于37 °C、5 %⑶2恒溫、 飽和濕度的條件下孵育12h。
[0055] (3)將熒光素酶檢測試劑盒中的5X裂解液配置成IX裂解液，備用。
[0056] (4)取出96孔酶標板，將培養基從孔中吸出，用IX PBS緩沖液洗滌細胞，洗滌結束 后將roS緩沖液吸出。每孔加入25或30yL的IX細胞裂解液，冰上裂解15min。裂解完畢，靜置 3-5min，吸取20yL的上清裂解液加入對應的96孔白色酶標板中。
[0057] (5)將白色酶標板放入Thermo Scientific Luminoskan Ascent化學發光微孔讀 數儀中，測試前向每孔加入lOOyL熒光素酶檢測試劑(將熒光素酶檢測試劑盒中1瓶熒光素 酶檢測底物與1瓶熒光素酶檢測緩沖液均勻混合制得），加入檢測試劑后lmin之內進行讀 數。
[0058]
[0059]
[0060]由上表看，大部分化合物其在低濃度下不能明顯的激活ARE，但在FP試驗中，IC50 最優的化合物1-14,1-15在10μΜ濃度下，能夠在有效激活ARE，且其誘導倍數明顯優于陽性 藥tBHQ。此外本專利小分子結構較為新穎，具有較好的透膜性1^叩？1-14(4.28±0.45)，1-15(4.81 ±0.45，）有望利用其LogP通過血腦屏障，開發為針對腦部的抗炎藥物。
【具體實施方式】 [0061 ] 實施例1
[0062] 2-(4-(N_(羧甲基)-4_甲氧基苯磺酰氨基））萘-1-氧基)苯乙酸
[0063] (1 )4_羥基萘-1-氨基甲酸叔丁酯（1-1)
[0064] 將 1-羥基-4-硝基萘（2 · 8g，14 · 8mmol)溶于30ml CH30H中，加入5% 鈀碳（157mg， 1.48mmol)，上接氫氣球，于室溫下反應。點板檢測反應完全，抽濾除去鈀碳，向濾液中加入 (Boc) 20(5. lml，22.2mmol)，三乙胺(4. lml，29.6mmol)于是室溫下N2保護反應5h.點板顯示 反應完全，旋去大部分甲醇，，加水，EA 20ml X 3提取，合并有機層，用飽和NaCl溶液10ml X 3 洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋干，用二氯甲烷打漿得灰色固體2.5g，產率65.1%。111.?.178.9- 1H,J = 7.95Hz,Ar-H)7.42-7.52(m,2H,Ar-H),7.84(d,lH,J = 7.92Hz,Ar-H) ,8.12(d,lH,J =7.83Hz,Ar-H),8.83(s,lH,-NH-),10.07(s,lH,-OH)；EI-MS m/z:260[M+H]+
[0065] (2)2-((4-叔丁氧羰基氨基)萘-1-氧基)_苯乙酸甲酯（1-2)
[0066] 將 1-1 (2.5g，9 · 6mmol)溶于 10ml DMF中，加入碳酸鉀（2.7g, 19 · 3mmol)，最后加入 溴苯乙酸甲酯（1.8ml，11.6mmol)于室溫下攪拌。點板反應完全，向溶液中加入水，用飽和 NH4C1溶液調節pH至7，用EA 20ml X 3提取，合并有機層，用飽和氯化鈉洗滌三次，直接制沙， 用PE: EA= 10 :1過柱，分離得灰色產品1 · 34g產率為34 · 1 % a · p · 198 · 8-200 · 5 °C · 匪R (300MHz, DMS0)51.46(s,9H,-Boc),3.66(s,3H,-0CH3),6.24(s,1H,-0CH-),6.90(d,lH,J = 8.34Hz,Ar-H),7.31(d,lH ,J = 8.16Hz,Ar-H),7.40-7.46(m,3H,Ar-H),7.56-7.58(m,2H, Ar-H),7.66-7.68(m,2H,Ar-H),7.91-7.94(m,lH,Ar-H),8.29-8.32(m,1H,Ar-H)9.00(s, 1H,-NH)；EI-MS m/z:430[M+Na]+
[0067] (3)2-((4-(4-甲氧基苯磺酰氨基)萘-1-氧基)_苯乙酸甲酯（1-3)
[0068] 將1-2(500.011^，1.2臟〇1)溶于10.01111〇12(：12中，加入〇卩3〇)0!1(5.01111，67.3111111〇1)， 于室溫下攪拌。點板反應完全(約0.5h)，用飽和Na 2C03溶液調節pH至7，用EA 20ml X 3提取， 合并有機層，用飽和氯化鈉洗滌三次，無水硫酸鈉干燥，旋干后得的灰色固體5，不經處理， 直接溶于· THF中，加入對甲氧基苯磺酰氯（322 · Omg，1 · 5mmol)，最后加入吡啶（197 · 7yL， 2.5mmol)于室溫下攪拌。點板顯示反應完全(約8h)，旋干THF，加入少量丙酮使油狀物溶解， 加入稀鹽酸溶液至出現渾濁，EA 20ml X 3提取，合并有機層，直接旋干制沙，用PE: EA = 8:1 過硅膠柱，分離得淡紫色固體185 . Omg，產率為34.4%，m. p. 223-225°C，匪R( 300MHz， DMS0)53.64(s,3H,-C00CH3),3.76(s,3H,~0CH3),6.20(s,lH,-〇CH~),6.81(d,1H,J= 8.43Hz,Ar-H),6.91-6.99(m,3H,Ar-H),7.39-7.55(m,7H,Ar-H),7.61-7.64(m,2H,Ar-H), 7.91-7.94(m,lH,Ar-H),8.21-8.24(m,lH,Ar-H),9.84(s,lH,-NH)；EI-MS m/z:500[M+Na]+
[0069] (4)2-(4-(4-甲氧基-N-(甲氧羰基甲基)苯磺酰氨基)萘-1-氧基)-苯乙酸甲酯（1-4)
[0070] 將化合物（1-3) (185 · Omg , 387 · Ομπιο?)溶于5ml DMF中，加入碳酸鉀（107 · Omg, 775 · Ομπιο 1)，最后加入溴乙酸甲酯（54yL，58Ιμπιο 1)于室溫下攪拌。點板反應完全(約2h),向 溶液中加入水，至溶液變渾濁，用飽和NH4C1溶液調節pH至7，有紫色固體析出，抽濾烘干的 紫色固體 138.Omg,產率為64.8%，m.p.l34-136°C，lH-NMR(300MHz，DMS0)S3