核酸分析用流動池和核酸分析裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及核酸分析用流動池(flow cell)和核酸分析裝置。
【背景技術】
[0002 ]確定DNA、RNA的堿基序列的新技術正逐步實用化。
[0003]在利用一直以來使用的電泳的方法中，預先調制由用于確定序列的DNA片段或RNA試樣進行逆轉錄反應而合成的cDNA片段試樣，利用眾所周知的桑格(Sanger)法實施雙脫氧(dideoxy)反應后進行電泳，通過計測分子量分離展開圖案進行解析。
[0004]對此，近年來，提出了通過將大量作為試樣的DNA片段固定于基板而并行確定大量片段的序列信息的方法。
[0005]在非專利文獻I中，使用微粒作為擔載DNA片段的載體，在微粒上進行PCR。之后，向設置有大量的使孔徑與微粒的尺寸配合的孔的板放入擔載有PCR擴增的DNA片段的微粒，以焦磷酸測序方式進行讀取。
[0006]此外，在非專利文獻2中，使用微粒作為擔載DNA片段的載體，在微粒上進行PCLi后，將微粒散布在玻璃基板上進行固定，在玻璃基板上進行酶反應(連接(Iigat1n))，與帶有熒光色素的引物結合而進行熒光檢測，得到各片段的序列信息。
[0007]進一步，在非專利文獻3中，將具有同一序列的許多DNA探針預先固定在基板上。此夕卜，將DNA試樣切斷后，使DNA探針序列和互補鏈的接頭(adaper)序列附加于各DNA試樣片段的端點。使它們在基板上雜交，從而使每一分子試樣DNA片段隨機固定在基板上。在該情況下，基板上不發生DNA延伸反應，結合帶有熒光色素的基質后，進行未反應基質的洗滌、熒光檢測，得到試樣DNA的序列信息。
[0008]如上所述，開發了通過在基板上固定大量核酸片段試樣而并行確定大量片段的序列信息的方法，從而逐步實用化。
[0009]專利文獻I中公開了并行確定大量序列信息的詳細內容。測序反應在內部具有流路的流動池中進行。流路表面涂覆有丙烯酰胺，在丙烯酰胺上接枝有正向引物和反向引物。將包含作為測定對象的多種模板的溶液導入流動池內后，對流動池施以溫度循環而在基板上進行擴增反應，從而在基板上形成與模板具有相同序列的多個菌落。一個菌落是擴增的多個復制模板的集合體，復制模板與測定對象模板具有相同的序列或互補的序列。擴增后，使測序引物與菌落內的模板雜交來進行測序反應。在測序反應中，使用W02004/018493所公開的核苷酸。核苷酸具有經由能夠被切斷的連接物(I inker)連接的的熒光分子和位于糖的第3位氧的離去基團。在測序反應中，使用來源于4種堿基A、T、C、G的4種核苷酸。4種核苷酸被各自不同的熒光色素標記。向流動池內注入包含聚合酶和4種核苷酸的溶液，使核苷酸與測序引物結合。之后，對結合有熒光的測序引物進行熒光檢測。此時，由于以形成與模板序列互補的序列的方式結合核苷酸，因此通過檢測結合后的核苷酸的焚光，可確定作為測定對象的模板的堿基序列。熒光檢測后，化學切斷分子內連接物而去除熒光分子。通過反復進行核苷酸結合、熒光檢測、熒光分子去除的循環而確定模板的堿基序列。
[0010]現有技術文獻
[0011]專利文獻
[0012]專利文獻1:美國專利申請公開第US2012/208194號說明書
[0013]專利文獻2:國際專利W02004/018493
[0014]專利文獻3:美國專利第US7897737B1號說明書
[0015]專利文獻4:美國專利第US8039817B1號說明書
[0016]專利文獻5:美國專利申請公開第US2009/208194號說明書
[0017]非專利文獻
[0018]非專利文獻1: Nature 2005，vol.437，pp.376-380
[0019]非專利文獻2:Science 2005，vol.309，pp.1728-1732
[0020]非專利文獻3:Science 2008，vol.320，pp.106-109
【發明內容】
[0021]發明所要解決的課題
[0022]關于專利文獻1、專利文獻2中記載的方法，由于以一定比例結合有與模板的堿基序列無關的錯誤的核苷酸，因此存在確定序列的正確性低的課題。此外，隨著模板的堿基長度變長，一個菌落中結合錯誤的核苷酸的模板的比例變高，從而正確的熒光信號減少。作為結果，存在無法使結合堿基長度變長的課題。一般而言，在序列確定過程中，確定短且零散的模板的堿基序列后，在電腦上比對零散的序列，如果結合堿基長度短，則還產生比對的精度降低或比對時間變長的課題。此外，一般而言，由于化學切斷中反應時間長，因此也存在每I次操作(run)所需的操作時間長的課題。
[0023]專利文獻3中公開了能夠提高核苷酸結合的正確性、縮短切斷反應時間的核苷酸。通過消除核苷酸內的糖的第3位氧的離去基團來提高聚合酶與核苷酸的親和性，從而提高結合時的正確性。此外，通過導入能夠以光化學切斷的分子內連接物而縮短切斷時間。另一方面，專利文獻3的核苷酸存在流動池內的光化學切斷反應的反應效率本身就低，結合堿基長度不夠長的課題。由于測序反應中進行多個循環的反應，因此一點點的反應效率的差異就會對增加循環數的結合時的熒光信號產生大的影響。例如，當I個循環的反應效率為99%時，250個循環后的熒光強度在將I個循環時的熒光強度設為100%時變為0.9925° X 100 =8.1(%)。另一方面，當為98%時，變為0.9825(^100 = 0.6(%)，僅僅1%的反應效率的差異形成8.1-0.6 = 7.5(%)的熒光強度的差異。作為提高光化學切斷反應的反應效率的方法，還有使光強度變強的方法，但如果使光強度過強，則會產生如下課題:發生由溶解氧等引起的自由基，并且發生由自由基導致的模板的二聚化反應等副反應，從而使與引物結合的核苷酸的量減少。在如專利文獻4所示的那樣對流路的上下兩面進行檢測的情況下，一般而言，離光化學反應的光源近的面的光強度比遠的面的光強度強，為了使遠的面的光強度變強，如果使光源的光強度變強，則近的面的光強度強于所需以上，從而發生上述的副反應。
[0024]本發明提供用于借助能夠光化學切斷的核苷酸的測序反應的核酸分析用流動池，其為提高切斷反應的反應效率的流動池。
[0025]用于解決課題的方法
[0026]本發明的核酸分析用流動池貼合有具備濾光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板(中抜含一卜)和透過第一光的第二基板，所述濾光片反射使流路內物質的化學結構發生變化的第一光。
[0027]發明效果
[0028]根據本發明，用于借助能夠光化學切斷的核苷酸的測序反應的核酸分析用流動池能夠提高光切斷反應的反應效率并且減少熒光檢測時的干擾。由此，能夠提高確定序列的正確性，縮短操作時間，使結合堿基長度變長。
【附圖說明】
[0029]圖1是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0030]圖2是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0031]圖3是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0032]圖4是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0033]圖5是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0034]圖6是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0035]圖7是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0036]圖8是用于說明本發明的核酸分析用流動池制造方法的一例的圖。
[0037]圖9是用于說明本發明的核酸分析裝置的一例的圖。
[0038]圖10是用于說明本發明的核酸分析裝置的一例的圖。
[0039]圖11是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
[0040]圖12是用于說明本發明的核酸分析用流動池構成的一例的圖。
【具體實施方式】
[0041]本發明的發明人進行了深入研究，結果完成了能夠實現核苷酸結合正確性高、切斷時間短、切斷效率也高的測序反應的核酸分析用流動池。
[0042]本發明是一種核酸分析用流動池，其貼合有具備濾光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透過第一光的第二基板，所述濾光片反射使流路內物質的化學結構發生變化的第一光。通過透過第二基板的第一光被濾光片反射，能夠對第二基板上、或第二基板和第一基板的濾光片上的分子內具有連接物的化合物從多個方向效率良好地照射第一光，因此能夠提高光化學反應的效率。高光化學反應的效率能夠提高確