使用合成信使rna無飼養層衍生人誘導多能干細胞的制作方法
【專利說明】使用合成信使RNA無飼養層衍生人誘導多能干細胞
[0001 ] 相關申請
[0002]本申請要求2013年5月13日提交的美國申請序列號13/893，166的權利并是它的部分連續案；該申請要求2012年5月13日提交的美國臨時申請序列號61/646,292的優先權的權利。這些申請的每一個的內容在此以其整體引為參考。
技術領域
[0003]本公開主要涉及用于通過受控方法使用一種或多種工程化的重編程因子來生成誘導多能干細胞(iPSC)的新方法和組合物。具體地，本公開涉及建立重編程因子的組合，所述組合包括常規重編程因子與反式激活結構域間的融合，其經優化用于多種細胞類型的重編程。更具體地，本文所公開的示例性方法可用于從多種哺乳動物細胞類型，包括非人的靈長類動物細胞產生誘導多能干細胞。還公開了使用合成的信使RNA，無飼養層衍生人誘導多能干細胞的示例性方法。
【背景技術】
[0004]以下包括了可能有助于理解本公開各個方面和實施方式的信息。這并非承認任何此處所提供的信息是現有技術，或與本文描述或要求保護的發明相關，或者任何明確或隱含引用的出版物或文件是現有技術。
[0005]誘導多能干細胞(iPSC)的治療潛能激發了開發重編程方法的努力，來回避對體細胞進行基因修飾以實現重編程進入多能狀態的需求。第一批在這方面成功實現的“非整合”方式一一蛋白轉導，質粒轉染和利用腺病毒載體一一由于得到的iPSC的轉化率低而在應用中受到限制。最近已證明，采用游離型DNA、仙臺病毒、和合成的信使RNA(mRNA)的技術產生的“無足跡” iPSC，得到的效率相當于或超過使用整合病毒載體得到的效率。RNA轉染原則上是這些方法中最有吸引力的，因為它提供對重編程因子(RF)表達時間過程的精確控制，而完全避免了對于“清理”被重編程的細胞以清除載體的殘余痕跡的任何要求。然而，由于為誘導人細胞中的多能性而要求每日重新轉染持續約2周的這一需求，目前基于mRNA的重編程流程相對勞動強度較大。這些過程還依賴于使用飼養層細胞，這增加了過程的復雜性和技術上的可變性，同時引入了非人源的(“異種”)的生物材料的潛在污染源。
[0006]生成誘導多能干細胞(iPSC)的主要困難是將分化細胞重編程為多能細胞的效率低。先前已經報道，當用由0ct4和MyoD的反式激活結構域(稱為M30)組成的融合基因，連同Sox2，Klf4和c-Myc(SKM)轉導的時候，5%的小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)被重編程成iPSC。此夕卜，在大多數轉導的MEF中，包括沒有成為iPSC的細胞中，M30促進多能性基因的染色質重塑。這些觀察表明了在給予更有利的培養條件下超過5%的細胞獲得成為iPSC的能力的可能性。
【發明內容】
[0007]由于RNA分子一旦被轉染到細胞，特別是哺乳動物細胞時由其引起的潛在的細胞免疫應答，用mRNA成功重編程非人源細胞一直難以實現。在重編程人成纖維細胞的過程中，通常的做法是使用一種病毒蛋白作為誘餌受體使轉染的mRNA分子誘導的干擾素減效。然而，使用誘餌受體的這種策略或其它類似策略都沒有成功地將源自非人類物種，包括狒狒、馬和狗的成纖維細胞重編程。
[0008]因此，為了解決這些缺陷，本公開提供了用于生成能夠產生身體的所有的不同組織的干細胞的方法和組合物。在某些方面，使用信使RNA分子且不需要病毒載體或飼養層細胞，本文公開的方法可用于將非人源成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞(iPSC)。與之前報道的細胞重編程方法學相比，使用的示例性方法和組合物產生了令人驚訝的和意想不到的改進效率，并且克服了先前未解決的在非人類哺乳動物細胞中抑制細胞免疫反應的問題。
[0009]因此，提供了方法、試劑和/或組合物，其可用于通過改進重編程因子(RF)混合物，特別是通過應用常規重編程因子，如0ct4(也被稱為0ct3/4)，SoX2等的工程化變體，并結合已知的強轉錄因子如VP16和MyoD的反式激活結構域而加速mRNA介導的重編程。本文所公開的方法和組合物得到了一個無飼養層的方案，其極大地減少了涉及基于mRNA的重編程的時間，成本和精力。
[0010]一方面，本公開提供了一種用于對體細胞進行去分化或重編程的方法，其包含:a)用組合物轉染分離的體細胞，所述組合物包含有效量的融合產物，該融合產物為選自0ct4、3(?2、1(1￡4、015^、他1108和1^1128的任意一種或多種合成1]11?嫩重編程因子與反式激活結構域之間形成的融合產物，從而所述體細胞被重編程或去分化。
[0011]在一個實施方式中，提供了權利要求1的方法，其中組合物包含融合于N末端的MyoD反式激活結構域的0ct4。在一個實施方式中，0ct4融合到三倍串聯形式的N-末端的MyoD反式激活結構域。
[0012]在一個方面，提供了用于通過使用權利要求1的重編程因子的合成mRNA中的任意一種或多種對哺乳動物細胞進行重編程的方法，所述方法包含:a)將靶細胞以1.5萬到50萬個細胞每標準6孔板的孔的密度生長在無飼養層表面上;b)重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉染細胞。
[0013]在一個實施方式中，靶細胞以3萬、7.5萬、10萬、或15萬細胞/標準6孔板的孔的密度生長在無飼養層表面上;b)重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉染細胞，而更早的時間點比稍后的時間點使用較低劑量;c)無需傳代而獲得iPSC。
[0014]在一個實施方式中，靶細胞以1.5萬、7.5萬、10萬、或15萬細胞/標準6孔板的孔的密度生長在無飼養層表面上，而每孔的體積調整為0.5ml至5ml之間的適當培養基；重編程期間用每次50ng/ml到800ng/ml mRNA的不同劑量轉染細胞，而更早的時間點比稍后的時間點使用較低劑量;無需傳代而獲得iPSC。
[0015]在特定實施方式中，在整個重編程過程中使用較低劑量減少了細胞免疫應答并產生了提高的iPSC成功率。在其他實施方式中，使用高純度的mRNA分子，即沒有來自體外轉錄的污染性異常轉錄本，使細胞得以以較低的密度植入，在重復轉染下存活，并獲得更高的iPSC的產量。
[0016]在一個實施方式中，所述哺乳動物細胞是人細胞。在一個實施方式中，所述方法無異種。在一個實施方式中，所述哺乳動物細胞是非人靈長類動物細胞。在一個實施方式中，所述非人靈長類動物細胞是食蟹猴細胞。
[0017]在一個實施方式中，所述一種或多種因子選自mRNA、調控RNA、siRNA、miRNA以及它們的組合。
[0018]在一個實施方式中，所述體細胞用至少兩種不同的RNA轉染。在一個實施方式中，所述體細胞選自單能、專能(multipotent)、多能(pluripotent)、以及分化的細胞。在一個實施方式中，所述一種或多種RNA誘導體細胞去分化成單能細胞、專能細胞、或多能細胞。
[0019]在一個實施方式中，所述至少一種因子選自0CT4，S0X2，NANOG，LIN28，KLF^PMYCmRNA。在一個實施方式中，0CT4，S0X2，NANOG，和LIN28的mRNA組合施用。在一個實施方式中，0CT4，S0X2，KLF4 和 MYC 的 mRNA 組合施用。
[0020]在一個實施方式中，將轉染的細胞保持在培養物中作為誘導多能干(iPS)細胞。在一個實施方式中，所述轉染的細胞形成誘導多能干細胞，其進一步包含誘導iPS細胞形成分化細胞。
[0021]在一個方面，提供了一種用于治療或抑制患者中的疾病或病癥的一種或多種癥狀的方法，其包括在體外去分化細胞和對所述患者施用所述細胞。在一個實施方式中，所述組合物還包含Rarg和LrH-1反式激活結構域。在一個實施方式中，所述組合物包含融合于VP16反式激活結構域的0CT4。
[0022]在一個實施方式中，本公開提供了源自非人靈長類動物細胞的iPSC，該細胞用于建立疾病模型系統，因為它們可以產生沒有其他動物產品的無內整合(in-1ntegrat1n-free)、無飼養層測試環境。因此，本文所述非人iPSC可用于臨床前測試。
[0023]本文描述和要求保護的發明具有許多屬性和實施方式，包括但不限于
【發明內容】
中闡述或描述或引用的屬性和實施方式。不意味著全部包含在內，本文描述和要求保護的發明并不限于或通過在
【發明內容】
中限定的特征和實施方式，其只以說明而非限制為目的包括在內。另外的實施方式可在以下【具體實施方式】中公開。
【附圖說明】
[0024]圖1.用基于M30的mRNA重編程混合物衍生得到的iPSC集落。
[0025](A)從第一基于M30的BJ重編程試驗衍生得出的增殖的iPSC克隆中的兩個的10倍亮場圖像。(B)增殖克隆針對多能性標志物的免疫染色。
[0026]圖2.使用基于M30混合物的無飼養層重編程。
[0027](A)免疫熒光成像顯示由5萬XFF成纖維細胞上的無飼養層衍生產生的TRA-1-60+集落，其比較了基于c-Myc和L-Myc混合物和4小時和24小時轉染方案。所有孔轉染9天。4小時轉染培養物在實驗的第15天進行固定染色，24小時轉染培養物在第11天。(B)來自同一實驗的400ng/ml的Stemfect孔的10倍亮場成像，其示出了在衍生的第9天，培養物中主要為近融合的hESC樣集落。(C)在再次用400ng/mL的Stemfect方案轉染10萬XFFs 9天的后續試驗中，標記視場的1X亮場時序，其示出上皮化和隨后出現了hESC樣集落。
[0028]圖3.使用4種不同的mRNA混合物的重編程效率的比較。流程圖總結了4種混合物對比試驗。
[0029]圖4.在HDF-a無飼養層重編程培養物中的hESC樣集落。在7.5萬HDF-a成體成纖維細胞無飼養層衍生的第9天，出現的hESC樣集落的10倍亮場圖像，使用Stemfect轉染試劑遞送作為培養基增補劑的400ng/ml mRNA混合物(M30+c_Myc+Nanog+)來處理所述成纖維細胞9天。
[0030]圖5.合成mRNA混合物的產生。(A)示意圖總結了制備mRNA重編程混合物的過程。
(B)在SYBR E-凝膠上的編碼數個RF和熒光報告分子的合成mRNA。每個泳道加入500ng的RNA0
[0031 ]圖6.用2-硫尿嘧啶產生合成mRNA混合物用作重編程混合物。在SYBR E-凝膠上的編碼數個RF的合成mRNA。所述mRNA的尿嘧啶堿基的1 %被2-硫尿嘧啶取代。每個泳道加入10ng的RNA。
[0032]圖7.使用mRNA混合物產生的人iPSC，其中mRNA被2-硫尿嘧啶修飾。在(A)Pluriton或(B)Allele重編程培養基中的不同重編程過程期間，重編程(A)7天后或(B)Il天后的人iPSC 群。
[0033]圖8.利用mRNA混合物在無飼養層重編程培養中產生的食蟹猴iPSC集落。圖中所示的是在第10天及13天出現的hESC樣集落的10倍亮場圖像。在第10天的圖中，鄰近中心的細胞顯示出從成纖維細胞向干細胞的形態變化。在第13天的圖中，細胞形成完全轉化的猴iPSC大集落。
【具體實施方式】
[0034]描述本發明時，所有未在本文中定義的術語具有本領域公認的其常用的含義。就下面的描述是本發明的【具體實施方式】或具體用途的程度而言，其意圖僅是說明性的，并不限制所要求保護的發明。以下的描述意在涵蓋包括在本發明的精神和范圍中的所有替換、修改和等同物。
[0035]通過選定的一組轉錄因子的表達，分化的細胞可以恢復為多能狀態，這打開了患者特異性細胞可能用于產生任何所需類型的細胞以用于遺傳性疾病的體外研究和最終用于細胞替代療