一種腫瘤分子檢測/診斷試劑的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生物醫藥領域，設及一種腫瘤分子檢測/診斷試劑，具體地，設及一種 W糞便作為檢測樣本的腫瘤分子檢測/診斷試劑。
【背景技術】
[0002] 目前在結直腸癌篩查上主要有兩種常用技術。
[0003] -種是大便隱血試驗。通常腸癌的發生演變在早期可W沒有任何征兆，癌細胞可 在大腸腸壁上生長數十年再轉移到其他部位，在沒有任何癥狀前，增生的組織可滲出少量 血液，血液進入大便被排出。而大便隱血試驗就是檢測大便中的血液成分(檢測對象是血紅 蛋白），若多次、持續的陽性反應提示消化道出血，應做進一步檢查W警惕腸道腫瘤的發生。 該法的優點是結果顯示快、清晰，結果可W半定量。但其存在一系列缺點：首先，其特異性 差，受飲食影響大。含亞鐵離子的食物和藥物對結果有干擾，假陽性率30%。隱血檢查前，指 導患者應避免服用鐵劑、動物血、肝類、瘦肉W及大量綠葉蔬菜3天，如有牙銀出血，誤咽下 血性唾液，W防糞便隱血檢查呈假陽性；其次，其敏感度低，出血量〉9化g/ml才能檢出；再 次，該方法學限制條件多：患者提前準備時間長，由于取材部位不同，反應時間不同，對顯色 的判斷不同，故在同一方法的試驗中，也可產生誤差，因此一般測試時候均要求患者采用不 同天的糞便樣品連續測定。
[0004] 另一種方法是腸鏡檢查。目前腸鏡檢查對于腸內病變診斷而言，是最有效可靠的 診斷方法。絕大多數早期腸癌患者可由內鏡檢查發現并確診。它通過肛口插入可檢查到直 腸、乙狀結腸、降結腸、橫結腸、升結腸和盲腸 W及與大腸相連的一小段小腸（回盲末端）。通 過鏡子不但可W清楚地發現腸道病變，還可對部分腸道病變進行治療，如:大腸息肉等良性 病變鏡下直接摘除，對腸道出血進行鏡下止血，對大腸內異物進行清除。腸鏡檢查技術是目 前其它診療手段無法替代的主要手段。目前腸鏡檢查對于腸內病變診斷而言，是最有效可 靠的診斷方法。然而，其也存在一系列的缺點：首先，其需要檢查前準備，作腸鏡需要在檢查 前3天開始進食流質或少渣半流質飲食，檢查當天上午空腹，檢查前一天開始服用甘露醇等 導瀉劑清潔腸道，服用的液體量通常高達化，清潔灌腸 W保證腸道的清潔度，之后不能再進 食。檢查時醫生會通過腸鏡向腸腔內注入一定量氣體使腸道膨大便于觀察。由于結腸結構 迂回曲折，檢查過程中被檢查者會有不同程度的脹痛或牽拉感覺。對于過分緊張或高度腸 疫李的受檢者，則需要使用鎮靜劑或解疫藥物。對于不能配合的小兒，則需要在麻醉下進 行。其次，其對醫生的操作熟練水平有很高的要求，初學者容易在腸鏡下遺漏病變部位造成 漏診。由于檢查過程中需要注入氣體，會使腸內壓力增大，易引起穿孔。再次，病人在檢查過 程中費力，費時，有一定的痛苦。并且檢查費用高，較難大規模推廣。
[0005] 除了上述兩種方法之外，分子診斷方法是近年來發展迅速的癌癥診斷方法。目前， 已有大量的結直腸癌分子標記物在組織和血液樣本中被研究和報道，初步估算已多達130 多種。
[0006] 由于組織取樣創傷太大，因此，已有研究著重于糞便樣本中的腸癌標記物的篩查。 例如，伍勇等嘗試通過檢測糞便中的標記物4?0、1(-阿3、953，并進一步結合。081'進行聯合診 斷。
[0007] 但由于一方面糞便當中存在多種酶類，會對脫落至糞便中的DNA起到消化、降解作 用，另一方面糞便成分復雜，干擾成分過多，因此，檢測結果通常差強人意，對于同一目標基 因，在糞便樣本中的檢測敏感性和特異性，都遠遠低于在組織樣本中的敏感性和特異性，嚴 重影響了結果的判斷。比如vimentin基因在組織中對結直腸癌的敏感性為83.0%，但在糞 便中的敏感性降為46% (J 化tl Cancer Inst.2005Aug 3;97(15) :1124-32. );SFRP1 和 SFRP2基因在組織中對結直腸癌有很高的特異性和敏感性，SFRP1基因在組織中特異性為 100%和敏感性為95.1 % (Nat Genet. 2002化η; 31 (2): 141-9 .)，而在糞便中敏感性降為 52%(Adv Biomed Res.2012Dec 28;1:87.);SFRP2基因在組織中對結直腸癌的特異性為 99%和敏感性為89.5 % (Nat Genet. 2002化η; 31 (2): 141-9 .)，而在糞便中特異性降為 77 %，敏感性降為77 % (Lancet. 2004Apr 17; 363(9417): 1283-5.)。
[0008] 因此，糞便樣本的分子檢測，目前仍很難應用于臨床檢測。
【發明內容】
[0009] 本發明目的在于篩選出一種在糞便中的檢測敏感性不亞于組織中的腫瘤標記物。
[0010] 本發明的進一步目的在于提供一種能W糞便作為檢測樣本的腫瘤分子檢測/診斷 試劑。其可W對結直腸癌或癌前腺瘤進行分子檢測/診斷。并且該檢測試劑即使W糞便作為 檢測樣本仍能獲得很好的敏感性和特異性。
[0011] 本發明首次篩選出一種分子標記物，與其他分子標記物不同的是，該分子標記物 在糞便中的檢出量與結直腸癌存在極高的對應關系。其檢測結果的敏感性和特異性甚至不 亞于組織樣本中的檢測結果。
[0012] 發明提供了一種結直腸癌分子檢測/診斷試劑，其特征在于W糞便作為檢測樣本， 并且含有SDC2基因甲基化檢測試劑。
[0013] 本發明篩選出的運個特殊的分子標記物即是SDC2基因。
[0014] SDC2基因是已知的一種參與細胞分裂、遷移和在結腸間充質細胞中表達的蛋白 質。據發現，腫瘤組織中SDC2目標區域的甲基化水平，顯著地更高于成對相鄰非腫瘤組織中 的SDC2目標區域。通過分析133例CRC患者原發腫瘤和其成對相鄰非腫瘤組織樣本中的SDC2 甲基化水平，研究人員發現，SDC2基因的轉錄調控區域中，腫瘤組織樣本顯示甲基化水平顯 著地更高于對照的相鄰非腫瘤組織樣本。
[0015] SDC2基因發生甲基化的位點相對恒定，多發生在啟動子區的CpG島。目前，常用的 SDC2基因甲基化檢測方法多為針對CpG島固定位點的甲基化檢測。
[0016] 甲基化的發生是胞喀晚上多了一個甲基，經過亞硫酸氨鹽處理后，胞喀晚會變成 脈喀晚，因為在進行PCR擴增時尿喀晚與胸腺喀晚相似而會被識別為胸腺喀晚，體現在PCR 擴增序列上就是沒有發生甲基化的胞喀晚變成了胸腺喀晚(C變成T)，甲基化的胞喀晚(C) 則不會發生變化。PCR檢測甲基化基因的技術通常為MSP，針對處理后的甲基化片段（即片段 中未改變的C)設計引物，進行PCR擴增，如果有擴增則說明發生了甲基化，無擴增則沒有甲 基化。
[0017] SDC2基因在組織中的甲基化水平與結直腸癌的發病關聯度是很高的。139例組織 中SDC2基因甲基化檢出率為97.8%，131例腸癌和125例正常患者的血液檢測中，特異性為 95.2%時，敏感性為87%(0h,T.,et al.,The Journal of Molecular Diagnostics, 2013)。而讓發明人意外的發現是，SDC2基因在糞便中所檢出的甲基化水平與結直腸癌的發 病也保持了極高的關聯度，其敏感性為87%，特異性高達98%，甚至高于組織中的特異性。 運在分子標記物中是極少見的，甚至是絕無僅有的。
[0018] 在發明人研究的多種分子標記物中，無一不是糞便樣本的檢測敏感性或特異性對 比組織樣本大幅下降。例如，NDRG4基因運種結直腸癌分子標記物，其在組織中的檢測敏感 性為81 %，但是，在糞便中的檢測敏感性降低至65.2% ;BMP3基因在組織中的檢測敏感性為 66 %，而在糞便中的檢測敏感性降低至39.0 %，Sept in9基因在組織中的檢測特異性為 90%，而在糞便中的檢測特異性降低至43%。研究發現，多種腸癌標記物僅在組織中顯示出 良好的檢測敏感性和特異性；而在糞便樣本中，無論如何設計和優化提取方法、檢測引物 等，敏感性或者特異性仍大幅下降，嚴重影響了腸癌的診斷。
[0019] 而SDC2基因在糞便樣本中仍然保持了高達87%的敏感性和98%的特異性，運使得 運種基因極其特別地可W作為糞便樣本中可靠的腸癌標記物。
[0020] 進一步地，發明提供了一種便于糞便中SDC2基因的提取和檢測的方法。
[0021] 磁珠捕獲方法是采用磁珠作為固相吸附載體并使用特定設計的試劑體系及提取 流程（Journal of畑ina Medical University應用磁珠法檢測并提取尿液游離甲基化 DNA；2015,(!0))〇
[0022] 磁珠捕獲序列可W通過針對SDC2基因來設計。在本發明中，提供的示例性捕獲序 列如SEQ ID N0.1或SEQ ID ^.2所示。通過磁珠捕獲的方式，可^對糞便中的50〔2基因進 行提取和富集。
[0023] 糞便的處理方式可選地為:將糞便在緩沖液中混勻、離屯、、取上清至另外一個試管 中，加入帶有特定互補寡核巧酸捕獲探針（例如優選的S E Q I D N 0 . 1 : AGCCCGCGCACACGAATCCGGAGCAGAGTACCG)的磁珠至上清液中，經過解育雜交后，用磁鐵將磁 珠吸附于管壁一側，經過反復洗凈后，用緩沖液將目標基因 DNA洗脫。該法可W俘獲到目的 基因，富集的過程約為2個小時。
[0024] 被俘獲的DNA經過重亞硫酸鹽處理修飾后用于后續巧光定量PCR的檢測。
[0025] 進一步地，本發明針對甲基化多發和恒定的啟動子去CpG島來設計引物和探針。示 例性的引物如SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO.4;或沈Q ID NO. 5、SEQ ID NO.6;或沈Q ID NO. 7、 569 10側.8;或569 10顯.9、沈9 10側.10;或569 10顯.11、569 10^).12;或沈9 10 NO. 13、沈Q ID NO. 14;或沈Q ID NO. 15、沈Q ID NO. 16;或沈Q ID NO. 17、沈Q ID NO. 18;或 569 10側.19、569 10^).20;或569 10顯.21、569 10^).22;或沈9 10顯.23、569 10 NO. 24所示。
[00%] 在一個優選的實施例中，采用的引物為沈Q ID NO.3、SEQ ID NO.4。
[0027] 為了進一步方便結果的顯示，本發明設計了檢測探針。示例性的探針序列如SEQ ID NO. 25或SEQ ID NO. 26所示。在本發明的一個優選的實施例中，探針序列如SEQ ID NO. 26所示。
[0028] 與現有技術相比，本發明具有W下有益效果：
[0029] 1.本發明所提供的結直腸癌診斷試劑可W簡便地W糞便作為檢測樣本，對結直腸 癌進行可靠的診斷。本發明使用的檢測樣本是病人的糞便樣本。樣品獲得非常容易，而且不 會對病人造成任何的痛苦和不便。使用樣本量極少，取樣過程非常方便且對