玉米赤霉烯酮的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬納米生物傳感以及生物檢測技術領域，涉及玉米赤霉烯酮的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]玉米赤霉烯酮主要由禾谷鐮刀菌產生，粉紅鐮刀菌、竄珠鐮刀菌、三線鐮刀菌等多種鐮刀菌也能產生這種毒素。李季倫1980年研究發現，許多農作物如小麥、大豆等植物中也存在玉米赤霉稀酮。玉米赤霉稀酮主要污染玉米、小麥、大米、大麥、小米和燕麥等谷物。其中玉米的陽性檢出率為45%，最高含毒量可達到2909mg/kg;小麥的檢出率為20%，含毒量為0.364?11.05mg/kg。玉米赤霉稀酮的耐熱性較強，110°C下處理Ih才被完全破壞。
[0003]玉米赤霉烯酮具有雌激素樣作用，能造成動物急慢性中毒，引起動物繁殖機能異常甚至死亡，可給畜牧場造成巨大經濟損失。
[0004]因此對玉米赤霉烯酮檢測顯得十分必要。
[0005]現有分析方法有色譜、免疫法，前者靈敏度不夠，后者存在試劑貴、易失活等缺點。中國專利CN102443585A公開了一種玉米赤霉烯酮核酸適體及其應用，其可用于玉米赤霉烯酮的檢測，但存在生物標記的DNA價格昂貴的問題。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有技術中存在的問題，提供一種檢測玉米赤霉烯酮的方法，該方法包括如下步驟:
[0007](A)使玉米赤霉稀酮核酸適體(Apt)和可與玉米赤霉稀酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA( Sp)雜交，形成雜交鏈；
[0008](B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當待測樣品中有玉米赤霉烯酮存在時，雜交鏈選擇性地與玉米赤霉烯酮反應釋放出單鏈信號探針DNA;
[0009 ] (C)為了消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片，留下單鏈信號探針DNA;
[0010](D)利用銀離子在玉米赤霉烯酮核酸適體-玉米赤霉烯酮結合體中不能被還原生成熒光發射峰在630nm左右的銀納米簇，銀離子只在單鏈信號探針DNA(Sp)中還原并生成被Sp修飾的在630nm左右(發射峰位置)有強的熒光發射的銀納米簇的原理，在銀離子還原檢測體系中檢測體系的熒光強度，從而測定待測樣品中的真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。
[0011]所述銀離子還原檢測體系包括先后添加的銀離子和使銀離子迅速還原成單質銀的還原劑，例如硼氫化物。例如硼氫化鈉。步驟(D)的檢測例如包括依次先后向體系中加入銀離子溶液和硼氫化鈉溶液，反應后生成熒光發射峰在630nm左右的銀納米簇。
[0012]在一個實施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸適體為5’-GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0013]在一個實施方式中，所述可與玉米赤霉烯酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA為5，-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3，。
[OOM]本發明的檢測原理如下:先讓Apt與Sp雜交(下劃線部分)；當有玉米赤霉稀酮存在時，雜交鏈與玉米赤霉稀酮反應釋放出Sp;體系中存在Apt-Sp (剩余的)，Apt-玉米赤霉稀酮和Sp。銀離子在Apt-玉米赤霉稀酮中不能被還原生成焚光發射峰在630nm左右的銀納米簇，Apt-玉米赤霉稀酮的存在對測定無干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用外切酶，將雙鏈DNA切成碎片。此時體系中只留下Sp，銀離子在Sp存在下還原并生成被Sp修飾的焚光發射峰在630nm左右的銀納米簇，通過檢測體系的熒光強度，從而可以測定真菌毒素玉米赤霉烯酮的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，可以提高檢測的靈敏度和精度。
[0015]本發明另外提供了一種檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒，其至少包括:玉米赤霉烯酮核酸適體、可與玉米赤霉烯酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA、DNA擴增體系、外切酶、銀離子還原檢測體系。
[0016]在上述試劑盒的一個實施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸適體為5’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0017]在上述試劑盒的一個實施方式中，所述可與玉米赤霉稀酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3 ’。
[0018]在一個實施方式中，所述DNA擴增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液(dNTP)和Phi 29DNA聚合酶。
[0019]在一個實施方式中，所述外切酶為ExoIII核酸外切酶。
[0020]本發明還提供了一種可用于檢測玉米赤霉烯酮的玉米赤霉烯酮核酸適體，其堿基序列為5 ’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3，。
[0021 ]本發明的優點
[0022]根據本發明的檢測方法和試劑盒，可以消除干擾，提高玉米赤霉烯酮的檢測靈敏度和精度。
【附圖說明】
[0023]圖1為Sp-Ag納米簇熒光激發與發射光譜。
【具體實施方式】
[0024]以下通過【具體實施方式】來說明本發明。
[0025]本發明的檢測玉米赤霉烯酮的試劑盒至少包括:使玉米赤霉烯酮核酸適體、可與玉米赤霉烯酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA、DNA擴增體系、外切酶、銀離子還原檢測體系O
[0026]在上述試劑盒的一個實施方式中，所述玉米赤霉稀酮核酸適體為5’ -GCATCACTACAGTCATTACGCATCGTGGGGATGGGAGGTTGTTTACGCAGGAGATGTTAATCGTGTGAAGTGC-3’。
[0027]在上述試劑盒的一個實施方式中，所述可與玉米赤霉稀酮核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACTTCACACGATT-3 ’。
[0028]在一個實施方式中，所述DNA擴增體系包括緩沖溶液(Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2S04)、dNTP 和 Phi29DNA 聚合酶。
[0029]在一個實施方式中，所述外切酶為Exo III核酸外切酶。
[°03°]使Apt與Sp雜交(下劃線部分)；當