一種5’-核苷酸酶檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及體外診斷試劑領域，具體設及一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒及其制備 方法。
【背景技術】
[0002] 5'-核巧酸酶（5'-Nucleotidase, 5'-NT)測定主要用于肝膽系統疾病的診斷和骨 骼疾病的鑒別診斷。血清5'-NT活性升高主要見于肝膽系統疾病，如阻塞性黃痘、肝癌、肝炎 等，其活性增高可達2~6倍，且與病情嚴重程度呈正相關，且其活性變化與ALP-致。但骨骼 系統疾病，如腫瘤轉移、崎形性骨炎、何僕病、甲狀旁腺功能亢進等，通常ALP活性升高，而 5 '-NT正常。因此ALP和5 '-NT同時測定有助于肝膽和骨骼系統疾病的鑒別診斷。
[000引目前，臨床上對5 ' -NT的測定方法多采用酶法，該方法簡便快捷、結果相對可靠，對 肝膽疾患的診斷具有較高應用價值。但該方法在測定過程中，精密度不高，尤其是低值血清 樣本，而且還存在熱穩定性差W及冷藏過程中嚷嶺核巧憐酸化酶和黃嚷嶺氧化酶活性下降 快的問題，導致酶用量大，成本提高，另外ALP對5 ' -IMP的水解不能完全消除，從而造成測定 靈敏度低，重復性不佳，給臨床進一步推廣應用此方法帶來困難，市場上多采用β-甘油憐酸 鋼來降低ALP對5' -IMP的水解(PNP-XT0-P0D偶聯單一試劑勻相速率法測定血清5 ' -NT;出 處：中國衛生檢驗雜志2010年1月第20卷第1期;作者:潘利琴），一方面效果不好，另一方面 成本明顯增加，限制了臨床應用的推廣；另外，市場上常用18-冠酸-6來避免游離憐酸根與 儀離子發生沉淀導致的穩定性差，但此物料純度低時穩定效果差，且會增加試劑的空白吸 光度變化率，而純度高效果好的價格昂貴，極大地增加了成本，限制了臨床的廣泛應用。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為了解決現有的5'-核巧酸酶檢測試劑盒精密度和穩定性低的問 題，而提供一種5 核巧酸酶檢測試劑盒及其制備方法。
[0005] 本發明首先提供一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒，所述的試劑盒由試劑R1和試劑R2 組成：
[0006] 試劑 R1: 緩沖液 I 100-300mrnoi/l： 憐酸二氨鐘 15-40mmol/:L; 八90 0. 1-lOml/L： EDTA * 漲 1-6卿1〇1 凡； MgCU · 61U) 3-40mmol/L； 4-氨基安替比赫 1 -4mmol凡；
[0007] Proclin300 0. 01-(). 3ml/L； 八 K O.S-lOg/L； TritonX-305 0. l-5ml/L； 曝吟核昔麟酸化酶 0.1 -IKL'/I; 黃嘿吟氧化酶 0. 3-3化幾； 過氧化物酶 2-10KL7L;
[000引試劑R2: 緩沖液 Π 100-300nimol/Ls 寸氨酸 10-iOOmmol/L; 抓ΤΑ · 2K l-6mmol/L;
[0009] TOOS l-20mmol/L; Proc 1 i n：-K)0 0. 01-0. 3ml/L； 百'-IMP 5-100inmol/L：〇
[0010] 優選的是，所述的緩沖液巧日緩沖液Π 相同，選自PI陽s-K〇H、K出PO4-KOH或皿陽s- K0H中的一種。
[0011] 優選的是，所述的緩沖液I和緩沖液Π 的抑為7.0~7.7。
[0012] 本發明還提供一種5 核巧酸酶檢測試劑盒的制備方法，包括：
[0013] 步驟一:試劑R1的制備：
[0014] 1、在反應容器中先加入緩沖液I，攬拌溶解，然后依次加入憐酸二氨鐘、m)TA · 2K、 4-氨基安替比林、Proclin300和AES攬拌，調節溶液pH值調至7.0-7.7，得到混合溶液；
[0015] 2、在步驟1得到的混合溶液中依次加入A90、MgC12 · 6肥0、化itonX-305、嚷嶺核巧 憐酸化酶、黃嚷嶺氧化酶和過氧化物酶，攬拌均勻，得到試劑R1;
[0016] 步驟二:試劑R2的制備：
[0017] 1、在反應容器中先加入緩沖液Π ，攬拌溶解，然后加入甘氨酸和邸TA · 2K攬拌，調 節溶液pH值至7.0-7.7，得到混合溶液；
[001引 2、在步驟1得到的混合溶液中依次加入TOOS、Procl in300和5 ' -IMP攬拌均勻，得到 試劑R2。
[0019]優選的是，所述的試劑R1和R2的制備中，用K0H調節溶液抑值。
[0020] 優選的是，所述的K0H的濃度為4M。
[0021] 本發明的有益效果
[0022] 本發明首先提供一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒，所述的試劑盒由試劑R1和試劑R2 組成，與現有技術相對比，本發明所述試劑R1中含有AES和化itonX-305組成的復合穩定劑， 在提高試劑穩定性的同時能夠提高試劑的分散度，減小兩次空白定標之間的吸光度差異， 提高試劑盒精密度;R1中含有A90可有效防止憐酸儀沉淀的產生，替換了價格昂貴的18-冠 酸-6,既提高了試劑的穩定性、降低了試劑空白吸光度變化率，又極大地降低了成本，增加 了臨床廣泛應用的可能性;試劑R2中添加甘氨酸和抓TA · 2K來提高試劑盒檢測靈敏度和精 密度，同時甘氨酸的加入可W降低試劑空白吸光度。
[0023] 本發明還提供一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒的制備方法，該制備方法簡單、操作簡 便、原料易得，制備得到的試劑盒具有較高的靈敏度、精密度和穩定性。
【具體實施方式】
[0024] 本發明首先提供一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒，所述的試劑盒由試劑R1和試劑R2 組成：
[002引試劑R1: 緩沖液 I 100-30(-化imol./L; 憐酸二氨辟 巧-4Oim0l/L; 八90 0. 1-lOml/L； EDTA · 2K l-6mmol/L：· MgCU · 61W) 3-40ramol/L; 4-氨基安替化棘 1 -4:mmo 1 /L;
[0026] Pr〇(； 1 i n300 0. 0!-〇. 3nil/L； AhS 0.δ-lOg/L； TritonX-3腿 0. 噪嶺核昔鱗酸化酶 0. 1-1化幾； 黃囑嶺氧化酶 0. 3-:化1;幾； 過氧化物酶 2-10抓化；
[0027]試劑 R2: 緩沖浪 II 100-:W0nimoi/L; 寸氨酸 lO-lOOmmol/L; 孤ΤΑ · 2Κ l-6mmol/L；
[002引 TOOS l-20mraol/L； Proclin300 日.01-0. 3訊1/1_.; η' -HviP 5-100畫ο 1/1。
[0029] 按照本發明，所述的緩沖液I和緩沖液Π 相同，保證了試劑反應的靈敏度，選自 PIPES-K0H、K此Ρ04-Κ0Η或肥陽S-K0H中的一種，所述的緩沖液巧日緩沖液Π 的pH優選為7.0~ 7.7。所述的緩沖液I和緩沖液Π 主要作用是保證配制酶法試劑盒的過程中各組分的pH值保 持在一定范圍內，使各組分的酸堿度保持穩定，不會對其他物質的性能產生影響，同時又能 為酶促反應的進行提供適宜的抑值及適宜的離子強度，從而保證試劑盒整體性能的穩定， 使測試結果更準確。
[0030] 按照本發明，所述試劑R1中含有AES和化itonX-305組成的復合穩定劑，在提高試 劑穩定性的同時能夠提高試劑的分散度，減小兩次空白定標之間的吸光度差異，提高試劑 盒精密度。
[0031] 按照本發明，所述試劑R1中含有反應所必須的憐酸根離子和儀離子，但運兩種離 子能產生憐酸儀沉淀，使試劑盒在儲存過程中出現沉淀而導致試劑盒失效，R1中添加 A90可 有效防止憐酸儀沉淀的產生，使試劑盒在儲存過程中穩定，替換了價格昂貴的18-冠酸-6， 既提高了試劑的穩定性、降低了試劑空白吸光度變化率，又極大地降低了成本，增加了臨床 廣泛應用的可能性。
[0032] 按照本發明，所述試劑R1中原料選用鐘鹽而非鋼鹽，一方面降低化+對酶活性的抑 制作用，另一方面，K+可與Mg+聯合作用，對反應具有激活作用，縮短延遲時間，拓寬線性期， 更利于臨床應用。
[0033] 按照本發明，所述試劑R2中添加甘氨酸和抓TA · 2K來提高試劑盒檢測靈敏度和精 密度，同時甘氨酸的加入可W降低試劑空白吸光度。
[0034] 本發明還提供一種5'-核巧酸酶檢測試劑盒的制備方法，包括：
[00巧]步驟一:試劑R1的制備：
[0036] 1、在反應容器中先加入去離子水，然后加入緩沖液I，攬拌溶解，再依次加入憐酸 二氨鐘、EDTA · 2Κ、4-氨基安替比林、Proclin300和AES，攬拌完全溶解，優選在20°C下用堿 溶液調節溶液抑值至7.0-7.7，所述的堿溶液優選為ΚΟΗ,ΚΟΗ的濃度優選為4M，得到混合溶 液；
[0037] 2、在步驟1得到的混合溶液中加入Α90，待溶液中均無不溶性顆粒后，加入MgC12 · 細20攬拌混勻，再用移液器吸取化itonX-30巧日入上述反應容器中，攬拌混勻，最后加入嚷 嶺核巧憐酸化酶、黃嚷嶺氧化酶和過氧化物酶，用去離子水定容，攬拌均勻，得到試劑R1;
[0038] 步驟二:試劑R2的制備：
[0039] 1、在反應容器中先加入去離子水，然后加入緩沖液Π ，攬拌溶解，再加入甘氨酸和 抓ΤΑ · 2Κ，完全溶解，優選在20°C下用堿溶液調節溶液pH值調至7.0-7.7,所述的堿溶液優 選為KOH，KOH的濃度優選為4M，得到混合溶液；
[0040] 2、在步驟1得到的混合溶液中依次加入T00S、Proclin300和5'-IMP，用去離子水定 容，攬拌均勻，得到試劑R2。
[0041] 通過W下實施例進一步舉例描述本發明，并不W任何方式限制本發明，在