芽胞桿菌生物被膜形成能力評估方法及應用的培養基的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及芽胞桿菌生物被膜形成能力評估領域，具體地說是涉及評估和研究芽胞桿菌是否具有生物被膜形成能力以及形成能力強弱的方法及所應用的培養基，為篩選促進生物被膜形成能力的物質以及進一步開發這一類型的芽胞桿菌用于生物農藥和生物肥料提供支持。
【背景技術】
[0002]生物被膜(b1film)指細胞通過胞外基質緊密結合在一起形成的群體。生物被膜為細菌提供保護，使細菌防御各種環境因子及其組合、形形色色的抗生素、捕食者和人類的免疫系統。
[0003]芽胞桿菌是一種廣泛分布于各種不同生活環境中的革蘭氏陽性細菌，可以產生內生芽胞，在土壤和植物的表面普遍存在，同時還是植物體內常見的一種內生菌，對人畜無害，不污染環境。它生長速度快、營養需求簡單，在植物的表面易于存活、定殖和與繁殖，而且生產芽胞桿菌制劑的工藝簡單，制劑穩定，施用方便，存儲期長，是一種理想的生防微生物。由于自然界獲得的芽胞桿菌還需要在實驗室開展進一步的評估，其中用于土傳病害治理的芽胞桿菌要想發揮良好的防效，還需要具備良好的土壤和植物根際定殖能力。而芽胞桿菌能在土壤和植物根際良好定殖的關鍵是其生物被膜形成能力的強弱，因此評估芽胞桿菌類生防菌株生物被膜形成能力的強弱對于進一步開發芽胞桿菌用于生物農藥或生物肥料的產業化開發具有重要意義。此外，一些針對土傳病害的生物農藥，由于施用時需要接種到土壤中，待其萌發并在土壤中定殖才能進一步發揮作用，而土壤環境條件復雜，不合適的土壤理化因素如pH、鹽度、營養源以及微生物因素如病原菌分泌毒素的存在等，都會影響到芽胞的萌發并最終發揮效果。篩選和尋找促進芽胞桿菌在土壤和植物根際快速形成生物被膜的物質，有助于提高這一類生物農藥或生物制劑的田間應用效果及其穩定性。
[0004]在革蘭氏陽性細菌中，枯草芽胞桿菌的生物被膜形成研究成為模式和典范。枯草芽胞桿菌最著名的特點是在饑餓和高種群密度時形成感受態和芽胞，除此之外，還發現許多枯草芽胞桿菌能夠在固體平板上形成復雜具褶皺的菌落，并在液體表面形成薄皮，這種在固體表面或液體表面形成的結構即生物被膜。枯草芽胞桿菌生物被膜形成及其基因調控得到了深入的研究。
[0005]目前被深入研究生物被膜形成機制的枯草芽胞桿菌菌株為NCIB3610菌株。枯草芽胞桿菌生物被膜的形成涉及到多種轉錄調控因子，其中最核心的轉錄調控因子是SinR、SinI和兩種新鑒定的蛋白，YlbF和YmcA。轉錄調控因子SinR是控制枯草芽胞桿菌生物被膜形成轉換的主調控因子。SinR在枯草芽胞桿菌細胞中組成型表達，并在運動的細胞中抑制控制基質產生基因的轉錄，間接促進細胞之間保持分開和運動。當條件有利于生物被膜形成時，SinR的活性受到措抗。SinI和兩種新鑒定的蛋白(YlbF和YmcA)，直接和/或間接措抗SinR的活性，SinR活性降低后導致細胞的運動能力喪失，細胞之間形成鏈狀并開始分泌胞外基質，并最終形成穩定的具有三維結構的生物被膜。胞外基質由胞外多糖(EPS)和蛋白質TasA組成。
[0006]目前在微觀水平對枯草芽胞桿菌生物被膜的研究依賴超薄切片技術和高放大倍數熒光顯微鏡技術。在宏觀水平對枯草芽胞桿菌生物被膜形成的研究則依賴于枯草芽胞桿菌在不同液培養基表面形成的薄皮或固體培養基表面形成的菌落。目前常用的幾種培養基配方如下:
[0007](I)DSM培養基:Hamon and Lazazzera(2001)報道了評估和研究枯草芽胞桿菌生物被膜形成的方法，在該文章中，作者使用了PVC材質的96孔微量滴定板作為培養容器，培養基配方(DSM)為:LB培養基加0.15M的硫酸銨、10mM的磷酸鉀(pH7)、34mM梓檬酸鈉、ImM硫酸錳和0.1%的葡萄糖。其測定不同時間點芽胞桿菌生物被膜形成強度時采用了結晶紫染色的方法，將微量滴定板中未粘附成膜的游離細胞去除，并用緩沖液(0.15M硫酸銨、10mM磷酸鉀(pH7)、34mM梓檬酸鈉、ImM硫酸錳)清洗。粘附到微孔中的細菌使用1%的結晶紫染色20min，多余的結晶紫去除并用水漂洗。結晶紫染色后的細胞用200yL由80%和20%丙酮組成的洗脫液溶解，并測定溶解液OD57q的讀數，用于評估生物被膜厚度。這個方法非常適合與測定芽胞桿菌形成薄皮的能力。
[0008](2)MSgg培養基:Branda et al.(2004)在研究枯草芽胞桿菌生物被膜時提出了液體MSgg培養基，具體配方為5mM磷酸鉀(pH7.0)、10mM磷酸丙基嗎啉(pH7.0)、2mM氯化鎂、700μΜ氯化鈣、50μΜ氯化錳、50μΜ氯化鐵、ΙμΜ氯化鋅、2μΜ硫胺素、0.5%甘油、0.5%谷氨酸、50yg/mL色氨酸、50yg/mL苯丙氨酸。固體MSgg培養基在液體MSgg培養基中加入1.5%的瓊月旨。培養容器為培養皿。枯草芽胞桿菌在液體MSgg上能夠形成穩定的具有皺褶的薄皮，在固體MSgg培養基上則形成具有三維結構的菌落。
[0009](3)LB+Mn+甘油:Shemesh and Chai (2013)研究甘油和Mn促進枯草芽胞桿菌生物被膜形成研究時使用的培養基為LB培養基中加入I % (v/v)甘油和0.1mM硫酸錳。
[0010](4)MSN培養基:Beauregard et al.(2013)研究植物多糖對枯草芽胞桿菌薄皮形成影響時采用的培養容器為24孔微量滴定板，采用的培養基為MSN，配方為5mM磷酸鉀(pH7.0)、0.1M磷酸丙基嗎啉(pH7.0)，2mM氯化鎂、0.05mM氯化錳、ΙμΜ氯化鋅、2μΜ硫胺素、700μΜ氯化鈣、0.2%氯化銨。用于測定芽胞桿菌根際定殖能力時，在其中加入0.05%的甘油，或加入0.0 5 %的植物多糖用于測定薄皮的形成。該培養基從MSgg培養基演變而來。由于培養基中未提供芽胞桿菌生長所需的碳源，芽胞桿菌接入上述培養基中不能形成薄皮，加入芽胞桿菌能夠使用的碳源后，芽胞桿菌將會在微量滴定板中形成薄皮。
[0011]上述4種培養基均可以用于定性或定量研究枯草芽胞桿菌生物被膜形成，其中DSM培養基比較適合研究薄皮，制備成固體培養基后，枯草芽胞桿菌不能生長出具有褶皺的菌落。MSgg培養基既適合薄皮也適合菌落的生長。LB+Mn+甘油的培養基也適合薄皮和菌落的生長。MSN培養基適合評估碳源與枯草芽胞桿菌薄皮形成關系。也可以用上述培養基培養出薄皮后，利用結晶紫染色的方法對菌株的生物被膜形成能力進行定量評估。但是，除了 MSN培養基屬于專門設計用于評估生物被膜促進因子研究的培養基外，其它培養基因其本身就具備促進芽胞桿菌生物被膜形成能力，不適合用于生物被膜形成能力及促進因子的評估。
【發明內容】
[0012]本發明的一個目的在于提供一種快速便捷評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基組合。
[0013]本發明的該目的是通過如下方案實現的:
[0014]—種評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的培養基，其特征在于，所述培養基包括:
[0015]第一液體培養基，所述第一液體培養基包含的溶質及濃度為，10mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，ImM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，1%胰蛋白胨，0.1 %葡萄糖;在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調整PH為7.0;所述第一液體培養基的最終pH為7.0;
[0016]第二液體培養基，所述第二液體培養基包含的溶質及濃度為，10mM磷酸三鉀，34mM檸檬酸鈉，ImM硫酸鎂，0.1mM硫酸銨，0.3%牛肉膏，0.5% NaCl，I %細菌學蛋白胨，
0.1%葡萄糖;在制備過程中，先將所述磷酸三鉀溶入水并調整pH為7.0;所述第二液體培養基的最終pH為7.0。
[0017]由于第一液體培養基和第二液體培養基中使用蛋白胨的不同，芽胞桿菌接入第一液體培養液和第二液體培養基后會經歷的生長抑制時間不同，通過觀察在第一液體培養基和第二液體培養基形成薄皮的形態、時間長短就可以判斷出芽胞桿菌生物被膜形成能力。
[0018]本發明的另一目的在于提供一種快速便捷評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法。
[0019]本發明的該目的是通過如下方案實現的:
[0020]—種應用前述培養基評估芽胞桿菌生物被膜形成能力的方法，其特征在于，
[0021]將待測菌株用固體LB平板劃線，挑取單菌落于液體LB培養基中，在37°C下以180rpm的速度振蕩培養20小時，使菌液的OD6qq值達到0.8以上；
[0022]然后用新鮮的LB培養基稀釋菌液，使菌液的OD6qq達到0.02，用作待測菌種液，要求待測菌種液中芽胞桿菌的濃度達到106CFU/mL;
[0023]將滅菌后的第一液體培養基和第二液體培養基分別加入無菌平板中，將待測菌種液按照0.08 %?0.1 %的接種量滴加在2種培養基的表面，蓋上皿蓋后30°C靜置培養，分別在1211、2411、4811、7211觀察薄皮的形成；
[0024]如果能夠在第一液體培養基中形成完整的薄皮，但不能在第二液體培養基中形成完整薄皮的菌株，判定為屬于生