一種促進還原力再生提高微生物羥化dhea轉化效率的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高濃度去氫表雄酮(DHEA)投料條件下促進還原力再生來提高亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1羥化DHEA為7α，15α-羥基-去氫表雄酮(7α，15a-d1H-DHEA)的方法。
【背景技術】
[0002 ]去氫表雄酮(DHEA)是由腎上腺分泌的一種腎上腺激素硫酸DHEA (DHEAS)的前體物質，在治療神經系統疾病及機體免疫調節等方面具有廣泛的藥理活性。DHEA可作為中間體合成許多具有重要生理活性的留體化合物，如7a，15a-di0H-DHEA是合成新型口服避孕藥“優思明”的有效成分屈螺酮的前體化合物。由于7a，15a-di0H_DHEA具有重要的藥理作用和藥用價值，其市場前景十分可觀，因此如何提高底物DHEA投料濃度和7a，15a-di0H_DHEA產物得率成為當前留體藥物領域研究的一大熱點。
[0003]目前，已從自然界中篩選得到多個具有羥化DHEA生成7a，15a-di0H_DHEA能力的菌株。其中，Colletotrichum I ini對DHEA輕化能力最強，在搖瓶培養條件下，底物投料濃度為10g/L時，7a，15a-di0H_DHEA得率能達到30%左右。但由于菌株轉化活性不高，高濃度底物對菌體毒害作用強等生物轉化的本質問題，造成轉化過程中底物投料濃度和產物7a，Ka-di OH-DHEA 得率都比較低 ，這些問題直接成為7a，15a-di0H_DHEA工業生產中的瓶頸。留體的羥化反應是利用了真核細胞線粒體膜上的細胞色素P450的單加氧酶活力，羥化反應的反應式如下:
[0004]底物+NADPH+02—產物+NADP++H20
[0005]由該反應式可知，底物投料濃度、還原力的提供是影響留體羥化反應效率的重要因素。留體羥化過程中，NADPH不斷被消耗，不能為羥化反應提供足夠的還原力，從而直接影響羥化反應的正常進行。外源添加糖類物質，利用微生物自身代謝途徑促進還原力NADPH再生，工藝簡單，經濟適用。為了解決高濃度底物對菌體的毒害作用，提高產物7a，15a-di0H-DHEA得率，本專利建立了一種分批投加底物結合促進還原力再生，適用于大規模生產的C.lini ST-1轉化DHEA的5L發酵罐轉化工藝。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種高濃度DHEA投料條件下促進還原力再生來提高C.lini ST-1羥化DHEA生成7a，15a-di0H-DHEA的方法。本發明采用的生產菌株為2012年4月24日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC N0.650 I的亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST_l，通過分批加入底物DHEA降低高濃度底物對菌體的毒害作用，同時補加適量的葡萄糖提供足夠的營養物質促進還原力再生，最終實現高底物投料濃度、高底物高轉化率、高產物得率的要求。
[0007]應用上述微生物轉化DHEA生產7a，15a-di0H_DHEA的方法，其步驟如下:
[0008](I)采用保藏號為CGMCC N0.6501 的亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST_l為生產菌種，25-40°C，120-220r/min條件下活化培養得到種子液，將該種子液涂布到PDA培養基上;
[0009](2)制備C.1ini ST-1菌株的細胞液體培養物:挑取步驟(I)的I3DA固體培養基上的C.lini ST-1菌株一環，接種于已滅菌的裝有20-50mL種子培養基的250mL錐形瓶中，培養溫度為25-40°C，置搖床上以120-220r/min的轉速培養18-30h至對數生長中期，即得到C.liniST-1菌株的細胞液體培養物；
[0010](3)5L發酵罐中菌體生長:將步驟(2)中制備好的細胞液體培養物以8-10% (v/v)的接種量接入裝有發酵培養基的5L發酵罐中，裝液量為3L。在生長階段，培養溫度為25-400C，罐壓設為0.05MPa，轉速設為220-300r/min，通氣量為0.4-1.0vvm。通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平保持在10-20%，生長12h后，即得到適宜于DHEA轉化的液體培養液；
[0011](4)底物分批投加工藝:精確稱取三份5g/L粉末狀DHEA，于12h、16h、20h分別投入步驟(3)中的菌體培養液，使底物DHEA投料終濃度為15g/L，以降低高濃度底物的毒害作用。
[0012](5)促進還原力再生工藝:轉化18h時，加入15g/L葡萄糖作為還原力再生的營養物質，以促進發酵液中還原力的再生。
[0013](6)DHEA生物轉化:在轉化過程中，培養溫度為25_40°C，罐壓設為0.05MPa，通氣量為0.8-1.2vvm，轉速為300-450r/min，通過調節發酵罐的通氣量、轉速和罐壓來控制發酵液中溶氧水平保持在20-30%。通過發酵罐自動流加40%的醋酸或10%的氫氧化鈉來維持轉化體系的pH為6.5，轉化30-48h，即得轉化液。
[0014](7)產物檢測:將步驟(5)的轉化液在8000-12000r/min下離心5-10min，上清用等體積乙酸乙酯抽提7次，沉淀用適量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋轉蒸發儀中旋至有晶體出現，乙腈復溶晶體并通過0.22μπι的有機膜過濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析7α，15a-di0H-DHEA 的含量。
[0015]其中步驟(I)中所述的PDA培養基的成分及配比為:土豆200-500g/L;葡萄糖20-50g/L;酵母粉2-10g/L;瓊脂粉10-20g/L;pH自然，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min;步驟(2)所述種子培養基的成分及配比為:花生餅粉5_15g/L，葡萄糖20-50g/L;KCl l_5g/L;酵母粉10-30g/L；K2HPO4 0.1-5.0g/L；MgS04.7H20 0.l-5g/L；FeSO4.7H20 g/L;滅菌前調培養基的pH至6.5-7.5，在121°C高壓蒸汽下滅菌20min;步驟(3)所述發酵培養基的成分及配比為:葡萄糖20-50g/L;酵母粉10-30g/L;玉米漿3-10g/L;121°C高壓蒸汽下滅菌20min。步驟(4)所述補加葡萄糖成分及配比為:葡萄糖15g/L，121°C高壓蒸汽下滅菌20min。
[0016]本發明所述利用亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST_l轉化DHEA為7a，15a-d1H-DHEA的5L發酵罐工藝研究，首次將底物投料濃度提高至15g/L，并且能達到高底物轉化率、高產物得率的要求，此方法對微生物轉化留體化合物合成留體藥物中間體具有重要的借鑒意義。
【附圖說明】
[0017]圖1高底物投料條件下亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum lini)ST_l對DHEA的羥化過程研究。
[0018]圖2底物分批投加工藝對DHEA的羥化過程影響的研究。不同底物分批投料方式如下:A)精確稱取三份5g/L粉末狀DHEA，分別于12、16、20h，分別投入菌體培養液，使底物DHEA投料終濃度為精確稱取5g/L粉末狀DHEA，于12h投入菌體培養液，8h后投入10g/L底物，使底物DHEA投料終濃度為15g/L<X)精確稱取10g/L粉末狀DHEA，于12h投入菌體培養液，8h后投入5g/L底物，使底物DHEA投料終濃度為15g/L。
[0019]圖3底物分批投料與促進還原力再生工藝相結合的羥化策略對DHEA羥化過程影響的研究。該羥化策略如下:精確稱取三份5g/L粉末狀DHEA，于12h、16h、20h分別投入的菌體培養液，使底物DHEA投料終濃度為15g/L。轉化18h時，加入15g/L葡萄糖。
【具體實施方式】
[0020]實施例1高底物投料條件下亞麻刺盤孢霉(Colletotrichum Iini)ST_1對DHEA的羥化反應的研究
[0021](I)制備C.1ini ST-1細胞液體培養物
[0022]挑取PDA固體培養基上的C.liniST-1接種于裝有30mL新鮮液體種子培養基的250mL錐形瓶中，30°C、120-220r/min培養24h。再以8-10%(v/v)的接種量接入裝有發酵培養基的5L發酵罐中，裝液量為3L。在生長階段，培養溫度為25-40°C，罐壓設為0.05MPa，轉速設為220-300r/min，通氣量為0.4-1.0vvm，溶氧水平保持在10_20 %，生長12h后，即得到適宜于DHEA轉化的液體培養液；
[0023](2)DHEA 輕化反應
[0024]精確稱取15g/L粉末狀DHEA，于12h投入步驟(I)中