一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及生物技術領域，特別設及一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的 制備方法。
【背景技術】
[0002] 人的正常細胞會在數十次的自然穿傳代后變為衰老細胞，而每一次的細胞分裂都 使得染色體縮短，引至細胞趨于成熟和老化。而要抑制運種細胞的老化則需要保護染色體 中的端粒。端粒是真核生物染色體末端的一種特殊結構，實質上是一重復序列，作用是保持 染色體的完整性。端粒酶是一種由蛋白質和RNA構成的核糖核蛋白體，為RNA依賴的DNA聚合 酶，能將端粒片段加至端粒的末端，修復端粒原有的長度。據科學研究把端粒酶注入衰老細 胞中，能夠延長端粒長度，使細胞年輕化。
[0003] 多膚是氨基酸通過膚鍵連接形成的化合物，是機體細胞的主要組成成分。小分子 膚是由二到四個氨基酸組成的具有特定生物活性的膚類總稱。已有報道證實小分子膚具有 修復端粒末端及延長端粒長度的作用，即具有類似端粒酶的端粒保護作用。因此小分子膚 應用于化妝品中可獲得抗皺、抗衰老的良好效果。
[0004] 微生物發酵與酶解法是目前使用較為廣泛的兩種多膚的制備方法。微生物發酵法 的產物多為大分子膚，而酶解法也存在酶解效率低、酶用量大、生產成本高等問題。目前已 報道的增加酶解效率的方法主要有兩種:一種是對酶進行改性提高其生物活性和在不良環 境中的穩定性。如小分子化合物結合在酶上，使蛋白球表面親水化W提高酶的穩定性;另一 種是添加助酶解劑，降低酶與反應底物間的表面張力。如Seo等人研究發現Tween 20的加入 可有效增加纖維素與纖維素酶之間的接觸面積，從而提高纖維素酶的利用率，促進木質纖 維素的酶解(Bioresource Technology,2011,102:9605-9612)。本發明采用微生物發酵與 酶解相結合的方法，并W化學改性酶作為酶解助劑制備大米蛋白，該方法蛋白酶使用量低、 大米蛋白產量高且小分子膚含量高，所得的大米蛋白具有增加端粒長度的功效。
【發明內容】
[0005] 本發明要解決的技術問題是，提供一種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制 備方法，該方法蛋白酶使用量低、大米蛋白產量高且小分子膚含量高，所得的大米蛋白具有 增加端粒長度的功效。
[0006] -種具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白的制備方法，其特征在于:采用W下步 驟： 1) 將大米經粉粹、過濾預處理后，加水攬拌均勻，配成料液比為大米:水=1:1~100的混 合物，所述料液比為g/l; 2) 將步驟1)所得混合物在高壓鍋中在60~120 T的溫度下蒸煮30~60 min; 3) 蒸煮后的混合物降溫至40~60°C，然后添加占混合物質量分數0.1%~10%的地枯草芽 抱桿菌進行發酵，發酵溫度40~60°C，發酵濕度為50%~90%，發酵時間為24~72 h，發酵結束后 獲取發酵濾液待用； 4) 將步驟3)所得發酵濾液置于超聲槽中W5~100K監的頻率進行超聲處理，然后加入復 合蛋白酶溶液，形成酶解液，所述復合蛋白酶溶液由改性膜蛋白酶溶液、改性木瓜蛋白酶溶 液、PEG-100硬脂酸醋溶液按質量比1 a~10:1~10組成； 5) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調節步驟4)所得酶解液的抑為6.0~8.0，維持酶解溫度為25~ 50。(：，酶解60~240 min; 6) 酶解結束后，經60~80 T高溫滅酶，既得具有端粒酶保護作用的酶解大米蛋白。
[0007] 復合蛋白酶溶液的具體制備步驟如下： 所述改性膜蛋白酶溶液通過W下方法制備:在25T下，在抑=6的巧樣酸溶液中，邊攬拌 邊加入天然膜蛋白酶，待其完全溶解后，緩慢加入質量為其5倍的二甲基辛二酸亞胺醋，恒 溫反應12 h，停止反應，得到質量分數為10%的改性膜蛋白酶溶液； 所述改性木瓜蛋白酶溶液通過W下方法制備:在25T下，在抑=6的巧樣酸溶液中，邊攬 拌邊加入天然木瓜蛋白酶，待其完全溶解后，緩慢加入質量為其5倍的二甲基辛二酸亞胺 醋，恒溫反應12 h，停止反應，得到質量分數為10%的改性木瓜蛋白酶溶液； 所述PEG-100硬脂酸醋溶液為質量分數為10%的PEG-100硬脂酸醋水溶液。
[0008] 本發明使用微生物發酵與酶解法相結合，在微生物法將大米蛋白酶解成大分子膚 的基礎上采用酶解法進一步將大分子膚酶解成小分子膚，可W大大降低酶解過程中酶的使 用量。同時在酶解過程中W二甲基辛二酸亞胺醋改性的膜蛋白酶與木瓜蛋白酶代替天然的 蛋白酶，可顯著提高蛋白酶的生物活性和穩定性。再者首次將PEG-100硬脂酸醋作為助酶解 劑，用W降低蛋白酶與蛋白質之間的表面張力，增加二者之間的接觸面積，從而提高酶解效 率。與傳統的單一酶解法相比，本發明在較少蛋白酶的使用基礎上，實現了小分子膚轉化的 最大化。
[0009] 采用本發明方法所提取的小分子膚復合物中含有二膚β-丙氨酷-心組氨酸、β-丙 氨酸-甲基組氨酸，Ξ膚甘氨酸-k組氨酸-賴氨酸等易于吸收的小分子膚；四膚谷氨酸- k組氨酸-脯氨酸-β-丙氨酷及游離的氨基酸和未分解的蛋白。
[0010] 取實施例1、對比例1、對比例2制備的多膚復合物，利用高效液相色譜檢測其產物 中小分子膚的含量。結果顯示為，實施例1微生物發酵酶解法制得的產物中分子量在100~ 2000化之間的小分子膚含量為7.5 mg/L，對比例1復合酶解法制得的產物中分子量在100~ 2000化之間的小分子膚含量為1.2 mg/L，對比例2微生物發酵普通酶解法制得的產物中分 子量在100~2000化之間的小分子膚含量為0.43 mg/L，有效說明本發明在使用相同蛋白酶 的條件下可獲得較多的小分子膚產物。
[OOW 所述對比例1的多膚的制備方法，采用如下步驟： 1) 將大米經粉粹、過濾預處理后，加水攬拌均勻，配成料液比為1:80 g/L的酶解原液； 2) 將酶解原液置于超聲槽中W100 KHZ的頻率進行超聲，加入改性膜蛋白酶:改性木瓜 蛋白酶:PEG-100硬脂酸醋質量比為1:1:1的復合蛋白酶溶液； 3) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調節酶解液的抑為6.0,維持酶解溫度為35 DC，酶解時間為 240 min; 4) 酶解結束后經80 °C高溫滅酶后的產物，無需進一步提純便可添加至化妝品中進行 使用，其中分子量在100~2000化之間的小分子膚含量為1.2 mg/L。
[0012] 所述對比例2微生物發酵酶解水解大米蛋白的制備方法，采用如下步驟： 1) 將大米經粉粹、過濾預處理后，加水攬拌均勻，配成料液比為1:80 g/L的發酵原液； 2) 將發酵原液置于高壓鍋中W100 T的溫度蒸煮30 min; 3) 蒸煮后的發酵原液降溫至60T后，接入原料比例10%的地枯草芽抱桿菌，維持發酵溫 度為60T，發酵濕度為80%，發酵時間為64 h，發酵結束后過濾取濾液待用； 4) 將步驟3)獲得的濾液置于超聲槽中W100 K監的頻率進行超聲，加入天然膜蛋白酶： 天然木瓜蛋白酶質量比為1:10的復合天然蛋白酶溶液； 5) 采用巧樣酸與碳酸氨鋼調節酶解液的抑為6.0,維持酶解溫度為35 DC，酶解時間為 240 min； 6) 酶解結束后經80 °C高溫滅酶后的產物，無需進一步提純便可添加至化妝品中進行 使用，其中分子量在100~2000化之間的小分子膚含量為0.43 mg/L。
[0013] 使用定量聚合酶鏈反應(PCR)的方法來測量小分子膚對端粒長度的促增長作用。 選取5例健康人外周血樣本，每例兩份血樣，共10份，分為兩組a組(未加小分子膚的樣品巧 份和b組(加入實施例1的小分子膚樣品巧份，用端粒長度擴增引物對樣品進行PCR擴增，經 瓊脂糖凝膠電泳后得到DNA基因片段。最后采用PCR法測量端粒長度相對T/S(端粒/單拷貝） 比率，而T/S比率同端粒的平均長度呈正比關系，故端粒長度可根據T/S比值來確定。測試結 果如表1所示，結果發現，b組的T/S比值比a組高了 35%，說明小分子膚有增加端粒長度的效 果，具有與端粒酶相似的保護、穩定端粒的作用。
[0014] 表1小分子膚對端粒長度T/S比值的影響
將實施例1中的小分子膚復合物W1%的比例加入乳液中，通過測試人體皮膚彈性的變~ 化檢測其抗衰老效果。皮膚真皮層中的膠原纖維、彈力纖維W及填充于細胞間的氨基聚糖、 蛋白多糖與結合水W-定的排列組合方式賦予了皮膚彈性，皮膚彈性越好表明皮膚越年 輕，彈性是化妝品抗衰老功效評價的重要參數。
[0015] 具體方法如下:測試樣品為添加1%小分子膚成分的乳液和不添加小分子膚成分的 乳液。測試點標記:在每位受試者的左右前臂內側用模具標記測試區域(4 cm*6 cm),模具 上挖有桐孔，在桐孔邊標記各個測試探頭的測試點位置。樣品按2.0±0.1 mg/cm2的用量， 均勻涂于試驗區，每種樣品隨機選用受試者8名。通過皮膚彈性測試儀MPA580測定受試者前 臂內側標記點使用樣品前、使用樣品15 d，30 d后的皮膚彈性變化如圖1、圖2所示。從中可 W看出，添加小分子膚的產品使用后對皮膚的彈