一種在生物合成法生產順式-3-羥基-l-脯氨酸的系統中有效提高脯氨酸轉化率的方法
【技術領域】
[0001] -種在生物合成法生產順式-3-徑基-1H?氨酸的系統中有效提高脯氨酸轉化率 的方法，屬于微生物基因工程領域。
【背景技術】
[0002] 徑脯氨酸化y化〇xyproline，Hyp)為亞氨基酸，是脯氨酸徑基化后的產物，根據其 徑基化位置的不同，可分為3-徑脯氨酸(3-Hyp)或4-徑脯氨酸(4-Hyp)。自然界中反式-4-徑 脯氨酸較為常見，順式-3-徑基脯氨酸是動物組織蛋白如膠原等的重要組成部分。順式- 3-徑基A-脯氨酸廣泛應用于醫藥、營養和美容業等方面。
[0003] 目前，國內外生產徑脯氨酸的方法主要有3種：水解法，化學合成法W及生物合成 法。水解法主要用于提取動物骨膠原中的反式-4-徑脯氨酸[16]，由于順式-3-徑脯氨酸在 骨膠原中含量極少，因而無法通過常見的水解法獲得。已有的研究報道中，獲取順式-3-徑 脯氨酸的方法主要是化學合成法和微生物轉化法。
[0004] 生物合成法能將游離的脯氨酸通過脯氨酸-3-徑化酶的催化，轉化為順式-3-徑 基-1H?氨酸，但在生物細胞中，游離的脯氨酸也是一種可W被利用的碳源，所W有必要打 斷生物細胞的脯氨酸降解途徑，W阻止菌體降解脯氨酸。
[000引本發明所提供的使含有重組DNA的順式-3-徑脯氨酸生物合成系統活性增強的方 法，具有重要的工業應用價值。
【發明內容】
[0006] 針對生物合成法生產順式-3-徑基-1H?氨酸時，需降解脯氨酸會限制順式-3-徑 脯氨酸合成等缺點，本發明的目的是提供一種在生物合成法生產順式-3-徑基脯氨酸的 系統中能夠有效提高脯氨酸轉化率的方法。
[0007] 本發明是一種在生物合成法生產順式-3-徑基-1H?氨酸的系統中有效提高脯氨 酸轉化率的方法。其特征是:在利用生物細胞生產順式-3-徑基脯氨酸的過程中，通過打 斷生物細胞內的脯氨酸降解途徑來提高脯氨酸的有效轉化率及順式-3-徑基-1H?氨酸的 產量。
[000引本發明所述重組細胞的構建方法：
[0009] 1.含有脯氨酸-3-徑化酶基因的載體的構建
[0010] 根據大腸桿菌密碼子的偏好性，利用密碼子的簡并性在不改變氨基酸序列的基礎 上，消除低使用率的密碼子，優化脯氨酸-3-徑化酶基因，使得其更有利于在大腸桿菌中得 到表達。同時，選用色氨酸串聯啟動子作為其啟動子，對其進行優化，使得徑化酶基因得到 更為高效的表達。
[0011] 2.通過敲除基因 putA打斷細胞內的脯氨酸降解途徑
[001引putA化C: 1.5.99.81.5. 1.12)基因編碼的蛋白PutA同時具有脯氨酸脫氨酶 (PRODH)和Δ -化咯嘟-5-簇酸脫氨酶(P5C)兩個催化區域，從而將脯氨酸氧化為谷氨酸。首 先，通過PR0DH的作用，脯氨酸被氧化為化咯嘟-5-簇酸(P5C)同時禪合著輔酶Q的還原，之 后，P5C與水自發反應生成谷氨酸-丫 -半醒，再在Δ -化咯嘟-5-簇酸脫氨酶的催化作用下， 轉變為谷氨酸。同時化tA蛋白也是一種多功能的DNA結合轉錄因子，在脯氨酸供應不足的情 況下會作為轉錄阻遏子從而阻遏基因 putA和PU巧(表達的化巧是主要的脯氨酸轉運體）的 表達。
[0013] 敲除putA基因，可W有效的打斷細胞內由k脯氨酸降解為谷氨酸的過程，從而積 累更多的心脯氨酸，有利于徑脯氨酸的產生。
[0014] 3.重組大腸桿菌的發酵實驗
[001引 35°C、220巧m培養2地，包括化21(DE3)AputA(pET21a-pt巧2-冊P)，取發酵液測定 順式-3-徑脯氨酸的含量。
【附圖說明】
[0016] 圖1.順式-3-徑脯氨酸在大腸桿菌細胞中的生物轉化途徑。
[0017] 圖2.色氨酸啟動子質粒圖譜。
[001引圖3.表達質粒祀T21a-pt巧2-冊P圖譜。
【具體實施方式】
[0019] LB培養基：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5 % (W/V)酵母抽提物，1 % (W/V)化C1，pH 7.0- 7.2。
[0020] Amp(Kan)抗性平板：1 % (W/V)膜蛋白腺，0.5% (W/V)酵母抽提物，1% (W/V)化Cl， 1.5% (W/V)瓊脂糖，氨節青霉素(卡那霉素)50yg/mL。
[0021 ] 5XKCM(大腸桿菌轉化緩沖液）：0.5MKCl，0.15MCaCl2,0.化MMgCl2。
[00對順式-3-翔捕氨酸的定量測定:將發酵液離屯、后，取上清，稀釋到2.5mL后加于lOmL 試管中，之后加入0.2血化S04 · 5肥0(化S04 ·甜20濃度：0.05M)，然后依次加入0.5mLNa0H (NaOH濃度：2.5M)、0.5血H202 (0.5 % )、0.8血肥S04化2S04濃度：4M)、2血顯色劑（顯色劑： 稱取5g對二甲氨基苯甲醒，用45mL去離子水，緩慢加入55mL正丙醇)搖勻后迅速將試管移至 70°C水浴鍋中，保溫3min，再用冷水冷卻，最后用紫外分光光度計在560nm波長處測定吸光 值。
[0023] 實施例1:色氨酸串聯啟動子序列的設計
[0024] 色氨酸串聯啟動子來源于pt巧L1質粒，質粒圖譜如說明書附圖2,該質粒的色氨酸 啟動子來源于大腸桿菌K12菌株的色氨酸操縱子，是一個適合工業生產應用的強啟動子，在 SD序列跟起始密碼子序列之間有Cla I酶切位點，同時，色氨酸啟動子的-35區上游有化nd 虹酶切位點，運樣便于將啟動子連接到其他的表達載體上。由于兩個色氨酸啟動子串聯起 來可提高表達強度，因此，根據ptrpLl質粒的色氨酸啟動子序列，全基因合成色氨酸串聯啟 動子。
[0025] 通過優化色氨酸串聯啟動子，將化nd虹酶切位點AAGCTT修改為EcoR I酶切位點 GAATTC，同時，為了使串聯啟動子內部的酶切位點單一，因此將兩個色氨酸啟動子的結合部 位的Cla I酶切位點ATCGAT修改為ATGTCGAC，使得連接處變為Sal I酶切位點，同時，在第二 個色氨酸啟動子序列的Cla I酶切位點后面加入一個化nd虹酶切位點AAGCTT，運樣可利用 酶切等分子操作來優化SD序列與起始密碼子之間的距離，使得目的基因得到高效表達。
[0026] 本實施方式中色氨酸啟動子基因序列的原始序列，見SEQ ID NO: 1。本實施方式中 優化的色氨酸串聯啟動子序列為人工合成;優化的色氨酸串聯啟動子序列見SEQ ID N0:2。
[0027] 實施例2:脯氨酸-3-徑化酶基