馬鈴薯卷葉病毒重組cp抗體在制備檢測試紙條中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種檢測馬鈴馨卷葉病毒的器具，特別是設及馬鈴馨卷葉病毒重組CP 抗體在制備檢測試紙條中的應用。
【背景技術】
[0002] 馬鈴馨已成為世界第四大糧食作物，也是中國第四大主糧作物，現我國馬鈴馨種 植面積和產量均居世界首位，其對于我國的糧食安全具有重要作用。馬鈴馨卷葉病毒 (potato leaf roll virus化RV)是最重要的馬鈴馨病毒性病害，在所有種植馬鈴馨的國 家發生非常普遍，易感品種的產量損失可高達90 %，一般減產40 %-70%。該病毒通過曬蟲 傳播，也通過感染病毒的塊莖傳播。病毒通過曬蟲W持久方式傳播，其中桃曬（Myzus persicae)是最重要的傳播介體，還能通過嫁接傳播，但不能經汁液機械接種傳毒。PLRV自 然寄主范圍有限，20多種可侵染的寄主植物主要為茄科植物，還有部分寬科、假茄科 (Nolanaceae)、十字花科和馬齒寬科植物。病毒具有非常好的免疫原性，與屬內的甜菜西方 黃化病毒、甜菜輕型黃化病毒W及黃癥病毒科未歸類的煙草壞死矮化病毒、菜豆卷葉病毒 等有密切的血清學關系。感染病毒植株初期癥狀:上部葉片卷曲，尤其是小葉的基部。運些 葉片趨向于直立且一般是淡黃色。對許多品種而言，它們的顏色可能是紫色、粉紅色或紅 色。后期感染可能不會有癥狀，而且有些品種感染后并沒有癥狀。高感品種的塊莖馨肉中有 明顯的壞死組織。當年初次侵染的癥狀，主要表現病株頂部的幼嫩葉片直立變黃，小葉沿中 脈向上卷曲，小葉基部著有紫紅色。續發性為二次侵染（即用上年化RV初侵染塊莖，在下年 做種再發病)侵染的病株癥狀，表現全植株病狀較為嚴重，一般在馬鈴馨現蕾期W后，病株 葉片由下部至上部沿葉片中脈卷曲，呈匙狀，葉肉變脆呈革質化，葉背又是出現紫紅色，上 部葉片稱綠，重者全株葉片卷曲，整個植株矮化，塊莖變瘦小，馨肉呈現誘色網紋斑。初侵染 病株減產程度小于續發性侵染病株。
[0003] 病毒病素有"蔬菜癌癥"之稱，防治十分困難，已成為制約蔬菜產業、乃至主要農作 物發展的重要因素對病毒性危害，僅通過增加投入，像防治細菌和真菌病害那樣大量使用 農藥是無法控制的。培育抗性品種是減少病毒危害最有效的手段之一。但由于自然界缺乏 抗病毒種質資源，抗病毒育種將是一個長期和艱巨的攻關目標。進行種馨脫毒是大幅度提 高馬鈴馨生產水平的重要環節，也是投入少、見效快的途徑之一。而脫毒種馨的脫毒標準和 質量則直接影響脫毒種馨應用和推廣的成效，對此國內外已達成廣泛共識。建立有效的馬 鈴馨病毒檢測體系、完善檢測技術對提高馨類作物的產量具有重要意義。馬鈴馨病毒檢測 需要利用病毒分離鑒定、血清學檢測和病毒核酸檢測等實驗室檢測手段進行確切診斷。
[0004] 目前實驗室檢測運Ξ種病毒的方法有：（1)指示植物法的病毒分離與鑒定，PLRV采 用帶病毒曬蟲接種洋酸漿或曼巧羅，其靈敏度高，但完成整個檢測過程需1~2月，具有檢測 周期長且技術要求高的局限性。（2)血清學檢測主要包括瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、酶聯免 疫吸附試驗化LISA)等。AGI的式驗操作簡便、敏感性高、成本低，不需要復雜實驗設備，其缺 點是有交叉反應。DAS-ELISA是PLRV血清學診斷首選方法，是最敏感和特異的化RV抗體檢測 技術，其缺點在于高親和力單克隆抗體檢測試劑不易獲得。（3)用反轉錄一聚合酶鏈式反應 (RT-PCR)檢測樣品中的化RV核酸，RT-PCR和實時巧光定量PCR技術具有快速、特異、靈敏 及定量)等特點，在化RV核酸檢測中得到廣泛研究。病毒分離與鑒定和PCR檢測技術操作復 雜、需要儀器和較長的時間，不適合生產或現場的快速診斷需要。ELISA和AGID比病毒分離 與鑒定和PCR技術簡便、快速，常用來檢測^RWELISA)及其抗體，但仍不便于我國基層或現 場普遍推廣應用。因為化ISA仍需要酶標儀和試劑，較復雜的操作步驟和經驗，運些儀器、試 劑在基層或者缺乏，或者缺乏操作人員和保存條件。用斑點免疫金滲濾法即免疫試紙的方 法檢測病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，將抗原一抗體反應由化ISA的傳統液 相環境轉到固相濾膜上快速進行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金 的顯色狀況而判斷結果，因此該法比化ISA更簡便、快速和實用。
[0005] 快速制備大量高效價的抗血清是免疫學方法應用的關鍵。日前應用于馬鈴馨病毒 抗血清制備的抗原有提純病毒粒子及病毒外殼蛋白基因原核表達產物。W提純的病毒粒子 為抗原制備抗血清是常規途徑，過程是提純抗原，再W提純抗原免疫家兔，最后進行采血分 離抗血清。但是W提純的病毒粒體為抗原制備抗血清存在很多弊端，一些病毒(如化RV)在 寄主體內含量低，病毒分離提純困難，不易得到純化的病毒粒體，難W提純獲得足夠的抗 原。通過基因工程技術使病毒外殼蛋白基因在原核細胞中表達，W表達產物為抗原制備特 異性抗血清是一條制備病毒抗血清的新途徑。該方法克服了使用提純病毒粒體作為抗原制 備抗血清的種種弊端，同時可得到大量高特異性的抗血清，并且所構建的工程菌株可在低 溫下長期保存，根據需要隨時誘導表達。通過表達載體的構建可將外殼蛋白表達為天然蛋 白或融合蛋白，研究表明兩種類型的表達產物具有很好的免疫效果。馬鈴馨卷葉病毒CP基 因結構特殊，原核表達困難。Pichova等（2011)報道利用特殊的受體菌實現了化RV-CP基因 的原核表達，并制備了重組CP抗血清，但化ISA檢測顯示免疫反應信號弱。《馬鈴馨卷葉病毒 缺失突變CP基因的原核表達及抗血清的制備》公開了將化RV-CP基因進行缺失突變，實現了 其原核表達，并制備出了重組CP多克隆抗體，該抗體可用于化RV的DAS-化ISA檢測；但是此 種方法基因表達量偏低，純化較困難。并且目前未見馬鈴馨卷葉病毒重組CP單和/或多克隆 抗體用于組裝化ISA檢測試劑盒或膠體金試紙條的報道。
【發明內容】
[0006] 針對現有技術的不足，本發明提供一種祀T2化(+ )質粒在提高化RV-CP基因的表達 效率的應用。
[0007] 本發明采用W下技術方案：
[000引一種祀T22b( + )質粒在提高重組化RV-CP基因的表達效率的應用，所述重組化RV- CP基因為:從化RV-CP基因中刪除第52-177位核巧酸（如序列表SEQ ID NO.2所示），其它核 巧酸沒有改變，所述PLRV-CP基因如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0009] 一種重組載體，W祀T22b(+)質粒為起始載體，構建重組化RV-CP基因的原核表達 載體，所述重組化3￥-〔?基因為（如序列表56〇10^.2所示）：從化1?￥-〔?基因中刪除第52- 177位核巧酸，其它核巧酸沒有改變，所述PLRV-CP基因如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0010] 該重組載體的表達產物為20kDa(原來是34kDa)，只帶有化S標簽，沒有其他融合片 段，減少了融合片段對抗體制備的干擾。
[0011] 本發明還提供含有上述重組載體的重組表達菌，所述重組表達菌其出發菌株為大 腸桿菌化21。
[0012] 本發明還提供采用上述重組載體表達馬鈴馨卷葉病毒重組CP抗原的制備方法，包 括如下步驟：
[OOU] (1)將載體片段祀T2化(+ )與126bp缺失突變后的化RV-CP基因進行連接，構建得到 表達載體祀T2化-LRCP;
[0014] (2)將步驟（1)中的表達載體祀T2化-LRCP轉化至大腸桿菌，篩選陽性克隆，誘導表 達重組蛋白；
[0015] (3)大腸桿菌菌體總蛋白的提取和包涵體溶解，然后將目的蛋白LRCP進行純化，即 得馬鈴馨卷葉病毒重組CP抗原。
[0016] 步驟(1)中，具體構建表達載體的步驟是：
[0017] l)WpBAD-LRCP-126為模板，W分別含有Nde I與Hind III位點的引物擴增CP基 因，然后T-A克隆，獲得重組質粒PMD18-LRCP;
[001引 2)pMD18-LRCP進行Nde I與Hind III雙酶切后回收含CP基因的DNA片段；pET22b- PhTPS同樣進行Me I與化nd III雙酶切，回收載體大片段；
[0019] 3)將步驟2)中的兩個片段連接，即為產物化RV-CP基因（缺失突變基因）的原核表 達載體祀T2化-LRCP。
[0020] 步驟1)中，具體包括W下步驟：
[0021] ①從菌株 T0P10(pBAD-LRCP-126)提取質粒pBAD-LRCP-126;
[0022] ②PLRV-CP基因的PCR擴增
[0023] W質粒pBAD-LRCP-126為模板，WP1、P2(P1 序列為5' -CATATGAGTACGGTCGTGG-3'， 如序列表569 10^.3所示）；？2序列為5'-446(：1'1'1'刊66661'1'刊6〔44-3'，如序列表569 10 NO. 4所示)為上、下游引物，進行PCR擴增；
[0024] 擴增體系：質粒DNA，2化；P1，2.扣!^;P2，2.5化；dNTP，扣!^; 10 XPCR buffer，化!^; Taq酶，1化;(1地20，1^L
[0025] 擴增條件：94°C變性5min，然后進入循環：94°C，變性30s; 46°C，退火45s; 72°C，延 伸lmin"34個循環，最后72°C保溫10min;l%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的擴增結果。
[0026] ③PLRV-CP基因的回收
[0027] 在紫外燈下切下大小為5(K)bp左右的特異性DNA片段的膠條，稱重后加入膠條重量 3-6倍的buff er B2，50°C水浴5-lOmin，融化膠條;溶液移入吸附柱中，8000 X g離屯、30s;加 500μΙ Wash Solution ,9000 X g離屯、30s并重復洗涂一次;空吸附柱9000 X g離屯、Imin;吸附 柱放進 1.5mL離屯、管中，加入 15-40μΙ Elution Solution,靜置lmin，9000Xg離屯、30s。
[0028] ④T-A連接
[00巧]連接體系：pMDlST載體化L，化RV-CP基因小片段：3yL，連接Solution化L，dd出ο?μ L。金屬浴中16°C保溫30min。
[0030] ⑤D冊α感受態制備及其轉化，獲得D冊a(pMDlS-LRCP)，經培養后，提取得到重組質 粒PMD18-LRCP。
[0031 ]步驟2)中，回收含CP基因的DNA片段的具體步驟如下：
[0032] ①對重組質粒PMD18-LRCP進行雙酶切，酶切體系如下：質粒祉LNde nyLWnd虹 化UBuffer Κ化L，dd出ο化L，37°C，保溫6小時；
[0033] ②酶切產物于濃度為1 %的瓊脂糖凝膠中電泳，電極緩沖液和瓊脂糖凝膠使用TAE 緩沖液配置，瓊脂糖溶解后加入邸使其終濃度達到約0.化L/mL
[0034] ③在紫外燈下切下目的條帶的膠條，回收大小約為5(K)bp的CP基因的DM片段。
[0035] 步驟2)中，載體祀T2化(+ )大片段制備方法如下：
[0036] 從重組菌D冊a(pET22b-I%TPS)提取質粒祀T2化-PhTPS，經過Nde I與Hind虹雙酶 切后，回收大小約為5500bp的載體祀T2化(+ )大片段。其中，重組菌D冊a(pET22b-化TPS)的 構建通過常規基因工程的方法進行，其構建來源于文獻所述:《壇紫菜TPS基因的克隆及其 原核表達》鄧淑貞，王斌，高磊，牛倩雅，劉濤，翁曼麗，郭寶太，華北農學報2013，28(5):: 66- 73。
[0037] 步驟3)中，兩個片段連接方法如下：
[003引連接體系（20化）：祀T2化載體大片段化L，PLRV-CP基因小片段6化，DNA連接酶化L， 連接Buffer化L，dd出0化L，金屬浴中16°C過夜連接。
[0039] 步驟(2)中，優選大腸桿菌化21，E.coli化