伏馬毒素b1核酸適配體鏈置換探針的篩選及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及核酸適配體的應(yīng)用與開(kāi)發(fā)，具體為伏馬毒素 Bi核 酸適配體鏈置換探針的篩選及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 伏馬毒素(fumonisin)是一類(lèi)主要由串珠鑲刀菌產(chǎn)生的真菌毒素。伏馬毒素主要 存在于玉米及其制品中，此外還存在于大米、小麥、大麥、高梁、魏豆、蘆算、啤酒、牛奶和飼 料等農(nóng)產(chǎn)品及其加工品中。調(diào)查表明：世界各國(guó)的玉米及其制品，無(wú)論是人食用的食品還是 動(dòng)物用的飼料，普遍都受到伏馬毒素的污染，其中玉米的污染率達(dá)60% W上。目前至少已鑒 定出15種伏馬毒素類(lèi)似物，其中伏馬毒素 Bi(FBi)的毒性最強(qiáng)。研究證實(shí)，伏馬毒素可引起馬 腦白質(zhì)軟化癥和豬肺水腫綜合癥。世界衛(wèi)生組織國(guó)際腫瘤研究中屯、（IARC)于1993年評(píng)價(jià)了 伏馬毒素的毒性，并將其歸類(lèi)為可能的人類(lèi)致癌物；國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)的巧CFA最 近的評(píng)價(jià)結(jié)果指出其具有腎臟毒性。農(nóng)產(chǎn)品中存在的伏馬毒素已成為相關(guān)農(nóng)產(chǎn)品安全消 費(fèi)、國(guó)際貿(mào)易和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的限制因素，對(duì)人的健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成潛在危害。因 此，研究建立科學(xué)先進(jìn)、準(zhǔn)確可靠的伏馬毒素系列監(jiān)控技術(shù)，是控制我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品伏馬毒素污 染、保障農(nóng)產(chǎn)品安全消費(fèi)和人民身體健康的迫切需求。
[0003] 由于伏馬毒素不具有強(qiáng)的紫外吸收和巧光基團(tuán)，因此不像其它真菌毒素那樣易于 分析檢測(cè)。基于抗體的免疫檢測(cè)技術(shù)是真菌毒素的主流檢測(cè)技術(shù)，其中作為快速檢測(cè)技術(shù) 的巧光偏振檢測(cè)技術(shù)在國(guó)外已經(jīng)比較成熟，但是其所用的F&巧光標(biāo)記物如6-(4,6-二氯Ξ 嗦基）氨基巧光素(6-DTAF)相當(dāng)昂貴，導(dǎo)致檢測(cè)成本較高，不利于該技術(shù)的大面積推廣應(yīng) 用。
[0004] 核酸適配體作為一類(lèi)單鏈寡核巧酸，與祀分子發(fā)生特異性相互作用前后空間構(gòu)象 會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，與抗體相比具有可體外篩選獲得、熱穩(wěn)定性好、易于化學(xué)合成和修飾等 優(yōu)點(diǎn)，甚至能區(qū)分單抗無(wú)法實(shí)現(xiàn)的單個(gè)取代基差別的祀分子。2010年，Maureen McKeague報(bào) 道了伏馬毒素 Bi 的核酸適配體（Int.J. Mol. Sci. 2010，11:4864-4881 ;doi : 10.3390/ i加 S11124864)，但是針對(duì)該核酸適配體的相關(guān)應(yīng)用報(bào)道較少。
[0005] 針對(duì)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)的需求，充分利用巧光偏振檢測(cè)技術(shù)和核酸適配體 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明公開(kāi)了 FBi核酸適配體鏈置換探針的篩選，并開(kāi)發(fā)了基于該鏈置換探針 的FBi巧光偏振檢測(cè)技術(shù)，有助于建立適合我國(guó)國(guó)情的農(nóng)產(chǎn)品伏馬毒素監(jiān)控技術(shù)體系，滿(mǎn)足 當(dāng)前我國(guó)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品伏馬毒素污染監(jiān)控關(guān)鍵技術(shù)的迫切需要，對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品消費(fèi)安全和人民 生命健康意義重大，應(yīng)用前景廣闊。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種伏馬毒素 Bi核酸適配體的鏈置換探針，并提供基于該 鏈置換探針的伏馬毒素 Bi巧光偏振檢測(cè)方法，具有特異性高、穩(wěn)定性好、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] 一種伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針，所述置換探針為一段單鏈寡核巧酸，其 序列如SEQ ID N0:1。
[0009] 所述探針5'端修飾有FAM巧光基團(tuán)。
[0010] 所述探針與伏馬毒素 Bi核酸適配體互補(bǔ)。
[00川所述伏馬毒素 Bi核酸適配體序列如沈Q ID NO:6所示。
[0012] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針是通過(guò)巧光光譜法和巧光偏振法篩選的。
[0013] 伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針作為玉米和小麥中伏馬毒素 Bi的巧光偏振檢測(cè) 分析應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的有益效果：
[0015] (1)本發(fā)明公開(kāi)了 FBi核酸適配體鏈置換探針的篩選，為后續(xù)基于FBi核酸適配體鏈 置換探針的信號(hào)放大傳感技術(shù)研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[0016] (2)本發(fā)明開(kāi)發(fā)的基于該鏈置換探針的FBi巧光偏振檢測(cè)技術(shù)采用FBi核酸適配體 作為分子識(shí)別元件，與基于抗體的免疫檢測(cè)技術(shù)相比，具有非常好的特異性；同時(shí)，因核酸 的合成成本非常低廉，且已經(jīng)商業(yè)化，大大降低了檢測(cè)FBi的成本。
[0017] (3)本發(fā)明公開(kāi)的基于該鏈置換探針的FBi巧光偏振檢測(cè)技術(shù)為均相檢測(cè)技術(shù)，重 現(xiàn)性好，且操作簡(jiǎn)單方便且可實(shí)現(xiàn)大量樣品的平行檢測(cè)，有助于建立適合我國(guó)國(guó)情的農(nóng)產(chǎn) 品伏馬毒素監(jiān)控技術(shù)體系，滿(mǎn)足當(dāng)前我國(guó)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品伏馬毒素污染監(jiān)控關(guān)鍵技術(shù)的迫切需 要，對(duì)保障農(nóng)產(chǎn)品消費(fèi)安全和人民生命健康意義重大，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為鏈置換探針篩選圖；
[0019] 圖2為鏈置換探針優(yōu)化篩選圖；
[0020] 圖3為巧光光譜法評(píng)價(jià)FBi核酸適配體鏈置換探針的活性；
[0021 ]圖4為巧光偏振法評(píng)價(jià)FBi核酸適配體鏈置換探針的活性；
[0022] 圖5為標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】：
[0023] -種伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針，所述置換探針為一段單鏈寡核巧酸，其 序列如沈Q ID NO: 1所示。
[0024] 所述探針5'端修飾有FAM巧光基團(tuán)。
[0025] 所述探針與伏馬毒素 Bi核酸適配體互補(bǔ)。
[0026] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體序列如SEQ ID NO:6所示。
[0027] 所述伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針是通過(guò)巧光光譜法和巧光偏振法篩選的。
[0028] 伏馬毒素 Bi核酸適配體鏈置換探針作為玉米和小麥中伏馬毒素 Bi的巧光偏振檢測(cè) 分析應(yīng)用。
[0029] W下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，具體步驟如下：
[0030] 本發(fā)明中所用的。81核酸適配體序列為2010年1曰11'66111沈6曰邑116報(bào)道的。81核酸適 配體其序列如SEQ ID N0:6所示。與該核酸適配體互補(bǔ)的單鏈寡核巧酸序列的設(shè)計(jì)原則為： 一方面要保證室溫條件下雜交復(fù)合物不能解鏈;另一方面要保證FBi與核酸適配體結(jié)合時(shí)， 能將巧光基團(tuán)修飾的單鏈寡核巧酸片段競(jìng)爭(zhēng)下來(lái)。
[0031 ] 利用生物學(xué)在線(xiàn)計(jì)算軟件化ttp: //unafold. rna. a化any. edu/)，在1 X反應(yīng)緩沖 溶液條件下，溫度參數(shù)設(shè)為37°C，DNA濃度設(shè)置為O.luM，計(jì)算單鏈寡核巧酸片段與核酸適配 體雜交的融鏈溫度Tm，要求25°C含化含60°C。實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的所有單鏈寡核巧酸片段如表1 所示，5'端均修飾有FAM巧光基團(tuán)；FBi核酸適配體及其他巧光修飾探針均由上海生工公司 合成;FBi購(gòu)于PRIB0LAB公司，磁性納米粒子(直徑Ιμπι)購(gòu)于鄭州英諾生物科技有限公司。
[0032] 表1實(shí)驗(yàn)中所設(shè)計(jì)的單鏈寡核巧酸片段
[0033]
[0034] *:Tm計(jì)算利用在線(xiàn)軟件ht1:p://unafold.rna.a化any.edu/，參數(shù)設(shè)置：DNAat 37 °C，[DM] = le-7M，[Na+] = 0.105M，[Mg2+] = 0.003M。
[0035] IX反應(yīng)緩沖溶液溶解的FBi核酸適配體儲(chǔ)備液用之前經(jīng)95°C5min，冰水浴5min處 理。首先將FBi核酸適配體與巧光素修飾的鏈置換探針雜交形成雜交復(fù)合物，然后利用親和 素-生物素相互作用將該復(fù)合物組裝到磁性納米粒子表面。充分洗涂后用50nM的FBi標(biāo)準(zhǔn)溶 液