一種從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶的方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明屬于酶分離技術領域。更具體地，本發明涉及一種從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶的方法。
【【背景技術】】
[0002]脂肪酶(又稱三酰基甘油酯水解酶)是一類可催化三酰甘油酯及其他水不溶性酯類的水解、酯化、轉酯化等反應的酶類的總稱;脂肪酶可廣泛地應用于食品、皮革制造、生物柴油、醫療醫藥和洗滌劑等多個生產領域。許多動物、植物和微生物都可產脂肪酶，由于微生物易于培養、產脂肪酶種類繁多，并可通過微生物育種手段提高脂肪酶的產量，因此微生物產脂肪酶成為科研工作者的研究熱點。
[0003]許多研究證實了油可作為產脂肪酶微生物的碳源及酶表達誘導劑，這些誘導劑包括植物油(橄欖油、棕櫚油等)和動物油脂(三酰甘油、油酸等)。Gerardo等利用橄欖油或玉米油為碳源及誘導劑，在培養基中添加吐溫并在低通氣條件下培養解脂亞羅酵母合成脂肪酶；Venkatesagowda等以提取挪子油后的糟柏為原料發酵Lasiddiplodia theobromaeVBE-1，發現椰子油可增強脂肪酶的活性;Patrick以橄欖油作為Yarrowia Iipolytica培養的碳源，采用補料分批發酵所得酶活比分批發酵提高了 6倍，因此植物油或動物油的添加提高脂肪酶的活性在許多微生物發酵生產脂肪酶的工藝中普遍存在。作為碳源或誘導劑的油在微生物發酵脂肪酶的過程中發生乳化，使發酵液粘度增加，同時在發酵體系中必須存在一定濃度的油脂為微生物提供維持能一直到發酵結束;乳化油使發酵液粘度增加，難以通過離心、過濾等方式除去發酵液中的雜質，因此乳化油的存在影響了后續酶的提取工藝和干燥工藝。本發明基于此，發明了含油發酵液提取脂肪酶提的預處理工藝。
【
【發明內容】
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[0004][要解決的技術問題]
[0005]本發明的目的是提供一種從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶的方法。
[0006][技術方案]
[0007]本發明是通過下述技術方案實現的。
[0008]本發明涉及一種從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶的方法。
[0009 ]該提取方法的步驟如下:
[0010]往含植物油的微生物發酵液中加入為發酵液體積35?50%的正丙醇，攪拌均勻，接著采用離心分離法分離成固相、重相與輕相;所述的固相與輕液棄去；
[0011]所述的重相轉移到一種容器中，按照以克計載體重量與以毫升計重相的比是7?10: 100，往所述重相中加入玉米芯粉或花生殼粉載體，同時加入磷酸鈣pH調節劑以達到pH6.5?7.5，然后進行噴霧干燥，得到脂肪酶粉末。
[0012]根據本發明的一種優選實施方式，所述的微生物發酵液是采用常規發酵方法獲得的解脂亞羅酵母含量為16?17CFU的發酵液。
[0013]根據本發明的另一種優選實施方式，在所述微生物發酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml 以上。
[0014]根據本發明的另一種優選實施方式，所述的植物油是豆油、花生油或菜籽油;所述植物油的含量是以微生物發酵液重量計0.1?1.0%。
[0015]根據本發明的另一種優選實施方式，從加入正丙醇起至離心分離止的時間是小于Ih0
[0016]根據本發明的另一種優選實施方式，所述離心分離是在室溫與離心力6000g以上的條件下進行的。
[0017]根據本發明的另一種優選實施方式，在重相中的脂肪酶活性是所述微生物發酵液活性的80?92 %。
[0018]根據本發明的另一種優選實施方式，磷酸鈣pH調節劑的添加量是載體重量的30?45%。
[0019]根據本發明的另一種優選實施方式，所述載體的粒度是60?80目。
[0020]本發明涉及采用所述方法得到的脂肪酶。它的酶活性為20400?25500U/g。
[0021 ]下面將更詳細地描述本發明。
[0022]本發明涉及一種從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶的方法。
[0023]該提取方法的步驟如下:
[0024]往含植物油的微生物發酵液中加入為發酵液體積35?50%的正丙醇，攪拌均勻，接著采用離心分離法分離成固相、重相與輕相;所述的固相與輕液棄去。
[0025]根據本發明，所述的微生物發酵液是采用常規發酵方法獲得的解脂亞羅酵母含量為16?17CFU的發酵液。在本發明中，如果所述微生物發酵液的解脂亞羅酵母含量小于16CFU，則會脂肪酶活性較低;如果解脂亞羅酵母含量高于17CFU，則會脂肪酶產量較低；因此，解脂亞羅酵母含量為16?17CFU是合理的。
[0026]所述的常規發酵方法例如是CN101440350 A、發明名稱《一株高產脂肪酶的解脂亞羅酵母突變株、培養方法及其酶應用》描述的發酵方法。
[0027]根據本發明，在所述微生物發酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml以上。在本發明中，脂肪酶酶活性定義為Ig固體酶粉(或ImL液體酶)，在37°CpH8.0緩沖體系中，Imin水解底物產生IM1l的可滴定的脂肪酸，即為一個酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。在本發明中，如果脂肪酶酶活性小于5100U/ml是不可行的，這是因為脂肪酶發酵酶活越低，通過本方法預處理發酵液脂肪酶活性損失率越大。脂肪酶酶活性是根據文獻產脂肪酶黑曲霉搖瓶發酵條件優化研究(《生物技術通訊》，2015，31: 227-233)描述的方法測定的。
[0028]在本發明中，所述微生物發酵液中的植物油是豆油、花生油或菜籽油;所述植物油的含量是以微生物發酵液重量計0.1?1.0 %。如果植物油的含量小于0.1 %，則影響脂肪酶的誘導表達;如果植物油的含量大于1.0%,則通過影響溶氧傳遞而影響脂肪酶活性；因此，植物油的含量為0.1?1.0 %是合理，優選地是0.3?0.8 %，更優選地是0.4?0.6 %。
[0029]在本發明中，往微生物發酵液中加入正丙醇的作用在于萃取發酵體系中的植物油。如果正丙醇體積比例小于35%，則會植物油萃取不完全影響后續噴霧干燥效果;如果正丙醇體積比例高于50%，則會在植物油萃取過程中使脂肪酶活性顯著下降；因此，正丙醇體積比例為35?50%是恰當的。
[0030]優選地，從加入正丙醇起至離心分離止的時間是小于lh，因為這個時間超過Ih會出現脂肪酶活性顯著下降問題。
[0031]根據本發明，所述離心分離是在室溫與離心力6000g以上的條件下進行的。本發明進行離心分離使用的離心設備是目前市場上銷售的產品，例如由sigma公司銷售的臺式高速離心機。
[0032]使用離心分離設備將含正丙醇的微生物發酵液分離成固相、重相與輕相。固相與輕液棄去。將重相轉移到一種容器中，按照以克計載體重量與以毫升計重相的比是7?10:100，往所述重相中加入玉米芯粉或花生殼粉載體，同時加入磷酸鈣pH調節劑以達到pH6.5?7.5，然后進行噴霧干燥，得到脂肪酶粉末。
[0033]在本發明使用微生物發酵液中的脂肪酶酶活性是5100U/ml以上。在重相中的脂肪酶活性是所述微生物發酵液活性的80?92%。
[0034]根據本發明，磷酸鈣pH調節劑的添加量是載體重量的30?45%以達到重相的pH為6.5?7.5。所述玉米芯粉或花生殼粉載體的粒度是60?80目。
[0035]本發明涉及采用所述方法得到的脂肪酶。它的酶活性為20400?25500U/g。
[0036][有益效果]
[0037]本發明的有益效果是:本發明從含油發酵液中提取脂肪酶的方法操作簡單，本發明方法得到的脂肪酶的酶活損失〈20%;與現有乙醇-丙酮提取技術提取脂肪酶相比，脂肪酶活性損失降低30%。
【【具體實施方式】】
[0038]通過下述實施例將能夠更好地理解本發明。
[0039]實施例1:從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶
[0040]該實施例的實施步驟如下:
[0041]往解脂亞羅酵母含量106CFU、脂肪酶酶活性5100U/ml、豆油植物油含量以重量計
0.3%的發酵液中加入為發酵液體積40%的正丙醇，攪拌均勻，接著使用由sigma公司臺式離心機，在室溫與離心力6000g的條件下進行離心分離5min，分離成固相、重相與輕相。所述的固相與輕液棄去。從加入正丙醇起至離心分離止的時間是0.8h。
[0042]將其重相轉移到一種容器中，按照以克計載體重量與以毫升計重相的比是10:100，往所述重相中加入60目玉米芯粉載體，同時加入為載體重量38%的磷酸鈣pH調節劑，以達到pH 7.2，然后使用由無錫市現代噴霧干燥設備有限公司銷售的噴霧干燥設備在其進出口溫度分別為140°C與100°C的條件下進行干燥，于是得到酶活性為22399U/g的脂肪酶粉末，酶活性損失率=(理論酶活-噴霧干燥后酶活性)/理論酶活，本實施例中脂肪酶的酶活損失率為 12.1 % (理論酶活計算為5100U/ml X 1000^200 = 25500U/g)。
[0043]實施例:2:從含植物油的微生物發酵液中提取脂肪酶
[0044]該實施例的實施步驟如下:
[0045]往解脂亞羅酵母含