一種酯酶bse01701及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物化工和生物技術領域，具體設及一種醋酶BSE01701及其編碼基因 和應用。
【背景技術】
[0002] 醋酶化C 3.1.1.1)廣泛存在于動物、植物及微生物中，是一類催化水解或形成醋 鍵的酶，作用的底物通常是脂肪鏈小于十個碳原子的醋類。醋酶屬于α/β折疊水解酶超家 族，催化中屯、由絲氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和組氨酸組成，保守序列為絲氨酸附近的五膚 (GXSXG)序列。醋酶能催化水解、醋化、轉醋化等多種化學反應，是一種很重要的工業生物催 化劑，被廣泛運用于精細化工、洗涂、醫藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、廢水處理和飼料工 業等領域。從催化特性來看，醋酶具有高度的化學選擇性和立體異構選擇性，且反應不需要 輔酶、反應條件溫和、副產物少。在生產應用中的醋酶的另一顯著特點是它能在異相系統 (即油-水界面)或有機相中作用。在水相中，醋酶通常催化水解反應，而在有機相中，它卻能 催化醋化和轉醋化反應。通過微生物醋酶的生物轉化制備新型藥物中間體或者去除藥物消 旋體的非有效成分，是一種重要的手性技術，有著非常廣闊的應用前景，它可W為合成手性 藥物提供新的平臺，為大量制備光學純化合物提供新的方法。酶法選擇性拆分消旋體化合 物，具有立體專一性高，副反應少，產率高，產物光學純度好W及反應條件溫和的優點，所W 是一種被廣泛認可的拆分方法。
[0003] 高光學純的乳酸通常是可生物降解聚乳酸和多聚物產品的原料單體。聚k乳酸和 聚D-乳酸具有較高的烙點，從而提高塑料的性能。光學純的乳酸和其醋類同時也是制藥工 業重要的手性前體試劑。1^-乳酸和醋類是合成非醬體消炎鎮痛藥布洛芬的前體手性試劑。 D-乳酸常用于不對稱合成D-氨基酸。高等植物缺乏利用D-乳酸的相關酶類，由此不能合成 或分解D-乳酸醋類，因此常用D-乳酸醋類合成農藥。D-乳酸甲醋是(10-2-(4-?基苯氧基） 丙酸的前體物質，而(10-2-(4-?基苯氧基)丙酸是合成芳氧苯氧丙酸醋類除草劑的重要中 間體，市場缺口大。D-乳酸甲醋可W被進一步水解制備光學純D-乳酸。然而，工業上生產D- 乳酸比k乳酸更加困難，大部分光學純的乳酸制品主要是乳酸為原料。因此，需要開發 一種工藝更為簡單的可用于工業上制備光學純D-乳酸甲醋的新方法。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種新的醋酶BSE01701及其編碼基因和應用。
[0005] 本發明從一株來自海洋的芽抱桿菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121中開發得到一種 醋酶BSE01701及其編碼基因醋酶基因 bse01701，構建了含有醋酶基因 bse01701的重組表達 載體和基因工程菌，培養基因工程菌后獲得醋酶BSE01701，其可應用于催化醋類反應，并可 應用于制備D-乳酸甲醋。
[0006] 本發明的第一個目的是提供一種醋酶85601701，其氨基酸序列如56〇10^).2所 /J、- 〇
[0007]本發明的第二個目的是提供一種編碼所述的醋酶BSE01701的醋酶基因 bse01701。 [000引優選，所述的醋酶基因 bse01701的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009] 本發明還提供一種含有所述的醋酶基因 bse01701的重組表達載體。所述的表達載 體，優選為祀T-28a( + )載體。
[0010] 本發明還提供一種含有所述的醋酶基因 bse01701的基因工程菌。所述的基因工程 菌，優選為大腸桿菌化21 (DE3)。
[0011] 本發明的第Ξ個目的是提供所述的醋酶BSE01701在催化醋類水解、醋化或轉醋化 反應中的應用。
[0012] 優選，所述的應用是醋酶BSE01701在催化拆分化-乳酸甲醋反應得到D-乳酸甲醋 中的應用。
[OOU] 本發明的第四個目的是提供所述的醋酶BSE01701在耐受Ca2\Mn 2+、Tween-20、 Tween-80、Triton Χ-100、ΤΡΡ、正己燒和/或正庚燒環境下進行催化的應用。
[0014] 本發明的醋酶基因 bse01701來自深海來源的芽抱桿菌（Bacillus SP. )SCSI0 15121(其來源為:89° 29.22'E，10°00.12'N，-3400m，pH7.8,2°C)，保存在中國科學院南海海 洋研究所。本發明利用生物信息學分析方法，從基因組測序的芽抱桿菌(Bacillus SP.) SCSI0 15121中克隆得到醋酶基因 bse01701，全長為768bp(從起始密碼子到終止密碼子）， 其編碼的醋酶BSE01701含有255個氨基酸。將醋酶基因 bse01701與表達載體祀T-28a( + )連 接后轉化大腸桿菌化2UDE3)，培養并誘導表達后，得到了重組醋酶BSE01701。將純化的醋 酶BSE01701作為催化劑催化醋類水解反應，具有較好的穩定性，而且對部分表面活性劑及 有機溶劑的具有很好的耐受性，且對拆分具有較好的促進作用。醋酶BSE01701作為催化劑 常溫下可催化醋類水解反應，并可W選擇性的拆分化-乳酸甲醋，制備得到的D-乳酸甲醋的 光學純度可超過99%，產率可達61.79%。醋酶BSE01701的特性符合洗涂劑添加劑、綠色化 工業上的需求，可用于洗涂劑、生物醫藥、化妝品和精細化工等領域。
【附圖說明】
[0015] 圖1是醋酶BSE01701的SDS-PAGE電泳圖。其中，Μ為蛋白marker,泳道1為IPTG誘導 前的含有祀T-28a( + )-bse01701的大腸桿菌化2UDE3)粗蛋白，泳道2和3為IPTG誘導后的含 有祀Τ-28α (+) -bseO 1701的大腸桿菌化21 (DE3)粗蛋白，泳道4為純化的醋酶BSE01701蛋白。
[0016] 圖2是醋酶BSE01701對不同長度酷基側鏈的對硝基苯酪醋的特異性。
[0017 ] 圖3是抑對醋酶BSE01701活性的影響。其中，PBS為Na抽P〇4/Na出P0屬沖液。
[001引圖4是不同抑對醋酶BSE01701的穩定性影響。
[0019]圖5是溫度對醋酶BSE01701活性的影響。
[0020]圖6是不同溫度對醋酶BSE01701穩定性的影響。
[0021 ]圖7是金屬離子對醋酶BSE01701活性的影響 [0022]圖8是表面活性劑對醋酶BSE01701活性的影響 [0023 ]圖9是有機溶劑對醋酶BSE01701活性的影響
[0024] 圖10是D-乳酸甲醋和k乳酸甲醋標樣GC圖。
[0025] 圖11是BSE01701拆分Dk乳酸甲醋制備D-乳酸甲醋GC圖。
【具體實施方式】
[0026] W下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。
[0027] 實施例1:醋酶基因 bse01701開放閱讀框邊界確定及引物設計
[0028] 提取芽抱桿菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121的基因組DNA，經全基因組測序后，利 用生物信息學手段對基因組進行基因注釋，分析其中的醋酶基因，確定了其中醋酶基因 bse01701的開放閱讀框，其基因序列如SEQ ID N0.1所示，全長為768bp(從起始密碼子到終 止密碼子），其編碼的醋酶85601701的氨基酸序列如56〇10^.2所示，共255個氨基酸。根 據分析得到的醋酶基因 bseO 1701序列，設計全長擴增引物如下：上游引物：5^ - TGCTAGCCATATGATACAAATTGAGAATCAAGC-3^ (下劃線為Ndel酶切位點）；下游引物：5'- AGGAAGCTTTTATAAGTACGTTTCAAACCATT-3^ (下劃線為HindllI酶切位點）。
[0029] 實施例2:醋酶基因 bse01701的克隆及載體構建
[0030] 2.1 PCR 擴增
[0031] 將實施例1設計的引物（上游引物：5' -TGCTAGCCATATGATACAAATTGAGAATCAAGC-3'； 下游引物:5^ -AGGAAGCTTTTATAAGTACGTTTCAAACCATT-3^ )送至上海生物工程有限公司合成， 合成的引物使用TE緩沖液溶解成終濃度為ΙΟμΜ,Κ提取的芽抱桿菌(B acillus sp.)SCSI0 15121總DM作為DM模板，建立如表1所示反應體系：
[0032] 表1 PCR反應體系
[0033]
[0034] 使用W下PCR擴增程序擴增醋酶基因 bse01701:94°C變性5min; 94°C變性Imin，62 °C退火30s，72°C延伸1.5min，進行30個循環;72°C延伸lOmin，冷卻到18°C。
[0035] 將PCR產物在0.8%瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統中觀 察，回收75化P左右的條帶。PCR產物按照膠回收試劑盒的方法進行回收，使用20化無菌水洗 脫，得到純化回收的PCR產物。
[0036] 2.2 酶切
[0037] PCR產物使用W下體系進行酶切，酶切時間1.化。酶切體系為:NdenyL，化nd II11 化，DNA<0.3yg，滅菌的雙蒸水加至50化。酶切后按照膠回收試劑盒的方法回收，得到雙酶切 后的PCR產物。
[0038] 質粒祀T-28a( + )的雙酶切:挑取含有該質粒的大腸桿菌D冊α單菌落，過夜培養。使 用質粒提取試劑盒提取質粒，用NdeI和化nd III按W下體系雙酶切，酶切時間1.化。酶切體 系為:Ndel化L，化nd III 1化，DNA<0.3yg，滅菌的雙蒸水加至50化。酶切后在0.8%瓊脂糖 凝膠中電泳，按照膠回收試劑盒方法回收得到經過雙酶切的線性祀T-28a( + )載體。
[0039] 上述雙酶切使用的限制性內切酶為化ermo公司生產的快速內切酶，酶切后的純化 回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipu