一種從動物血塊提取、純化sod凍干粉的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物化學技術領域，具體說是一種從動物血塊提取、純化SOD凍干粉的生產方法，SOD凍干粉產品應用于食品、化妝品及藥品等領域。
[0002]
【背景技術】
[0003]自由基學說是在生命科學領域中，越來越被人們廣泛接受的關于生命體衰老理論的學說，該學說認為自由基是造成生命體老化及諸多疾病的重要原因。據估計80?90%的老化性、退行性疾病都與自由基有關，其中包括癌癥、老年癡呆癥、帕金森氏癥、皮膚色素沉積、白內障、心臟病等，所以清除自由基對維持健康體魄和保持年輕體態至關重要。
[0004]而SOD是專一的自由基清除劑。SOD是一種廣泛存在于動物、植物和微生物中，具有催化超氧陰離子自由基發生歧化反應的生物酶，其催化的歧化反應式如下:.〇2 +.02 + 2H+ —> H2O2 + 〇2
SOD能清除人體細胞內的超氧陰離子自由基(生物垃圾)，因而被譽為人體的生物垃圾清道夫，而自由基過多則導致多種疾病，因此人體適時適量補充S0D，就能預防甚至治療因自由基過多而導致的多種疾病，具有抗氧化、抗輻射、抗癌變、消炎等功能，用于治療或輔助治療心腦血管疾病、自身免疫性疾病、血液再灌注損傷、慢性炎癥和癌癥等，而且可用于日常的抗衰老保健，防治老年性疾病和慢性病等。
[0005]提取、純化SOD凍干粉從上世紀80年代末開始在我國興起，但到目前為止還沒有形成一個較大的產業，固然有市場方面的原因，也有技術方面的不成熟。本發明在前人研究的基礎上，突破了幾個關鍵技術點，并在本公司實現了規模化生產。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供了一種從動物血塊提取、純化SOD凍干粉的生產方法，可進行規模化生產。
[0008]本發明通過以下步驟來實現:動物血塊經破碎、乳化、溶血、沉淀、壓濾、超濾、熱變性、柱色譜、修飾、丙酮沉淀、凍干等工序，得到修飾SOD凍干粉產品，其步驟如下:
1)、收集牦牛、黃牛、豬、羊等多種動物在屠宰時的血液，自然凝固后濾去血清得到的新鮮血塊，或新鮮血塊冷凍儲藏后的冷凍血塊；
2)、用破碎機將大血塊破碎成小血塊；
3)、將破碎后的小血塊倒入乳化機中乳化15?40分鐘；
4)、將乳化后的血液，栗入到1.2?2.0倍血液體積的二級反滲透水中，攪拌30?60分鐘，使紅血球破膜而溶血，得溶血液；
5)、在常溫下，向溶血液中同時加入兩種無機鹽，使血紅蛋白沉淀下來，SOD溶解在懸濁液中；所述的一種無機鹽是氯化鈉，重量占溶血液體積的I.5?5.0%;另一種無機鹽是氯化銅，或硫酸銅，重量占溶血液體積的0.6?1.5%;
6)、將步驟5的懸濁液栗入到壓濾缸中，加壓過濾得到SOD壓濾液；
7)、將SOD壓濾液栗入到截留分子量為3000?10000D的中空纖維超濾器中，超濾濃縮，得到SOD濃縮液；
8)、將SOD濃縮液于55?65°C水浴中加熱10?30分鐘，冷卻后離心，去除雜蛋白沉淀，收集SOD熱變液；
9)、將SOD熱變液上樣到預先用平衡液平衡的SepharoseFast Flow色譜柱中，再用平衡液平衡6?15小時，至柱流出液A28q值為0.1以下;再用洗脫液洗脫，收集藍綠色SOD色譜帶的下柱液;所述的平衡液為pH 7.8的2.5 mmo I /L的Tr i s-HCl緩沖液，所述的洗脫液為含
0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl緩沖液;
10)、把SOD下柱液置于48?55°C的水浴中，用堿溶液調pH值至9.0?9.5，緩慢加入蛋白質修飾劑，反應1.2?1.5小時，冷卻后離心，得到修飾SOD液;所述的堿溶液是I?4mol/L的氫氧化鈉溶液，或I?4 mol/L的氫氧化鉀溶液，所述的蛋白質修飾劑是肉豆蔻酰氯；
11)、在修飾SOD液中加入1.4?2.0倍體積的冷丙酮，攪拌放置后SOD沉淀下來，再離心收集SOD沉淀；
12)、將SOD沉淀放置于凍干機中，進行真空冷凍干燥，得到修飾SOD凍干粉。
[0009]本發明具有以下幾個特點:
1、本發明采用的原料上使用凝固血塊，而不用加抗凝劑的紅血球，一般的提取是先按比例添加一定的抗凝劑而收集未凝固血液，再離心收集紅血球，用生理鹽水反復離心洗滌紅血球，這樣費時費力，離心負荷很大，且抗凝劑的比例掌握不好會發生凝血或溶血;而本發明是在收集血液時不加抗凝劑，也不用反復離心收集、洗滌紅血球，直接用自然凝固的血塊做原料，這樣省時省力，也不用離心，適于規模化生產。
[0010]2、本發明使用破碎機破碎大血塊成小血塊，便于下步的乳化，破碎機的產能大，I個班8小時I臺普通破碎機就能破碎1噸以上的血塊，適于規模化生產。
[0011]3、本發明在沉淀血紅蛋白時不用易揮發的乙醇，也不用有毒害的氯仿，而用無機鹽，不僅沉淀效果好，又減少了環境污染和對生產人員的身體傷害。
[0012]4、現有沉淀血紅蛋白分離SOD時，一般在此步驟需加熱整個溶血液(一罐I噸以上液體)，導致能耗大，且傳熱不均，溫度難以控制，SOD活性易損失。本發明在沉淀步驟加入無機鹽，無需加熱，用壓濾缸壓濾時分離效果好;僅在超濾濃縮后加熱，用于去除雜蛋白，體積已縮小40倍左右(I噸清亮的SOD壓濾液超濾濃縮至25L左右)，這樣能耗很小，溫度易控制，SOD活性幾乎無損失。
[0013]5、本發明在柱色譜時用Sepharose Fast Flow色譜介質，不僅流速快，而且該介質不受PH值、離子強度等因素的影響而膨脹或收縮，易于生產人員的操作。
[0014]6、本發明工藝簡單，操作方便，獲得的SOD比活性達10000 U/mg以上，蛋白含量達95%以上，每公斤血塊生產出SOD的總活力達45萬U以上，產品質量高。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明進一步說明。
[0016]實施例1 1)、收集新鮮黃牛血液，經過濾后得到黃牛血塊500公斤；
2)、用破碎機將大血塊破碎成小血塊；
3)、將破碎后的小血塊倒入乳化機中，乳化20分鐘；
4)、將乳化后的血液，栗入到750L的電導率為3us/cm的二級反滲透水中，攪拌40分鐘，使紅血球破膜而溶血，得溶血液1250L;
5)、在常溫下，向溶血液中加入40公斤氯化鈉和15公斤氯化銅，邊加邊攪拌，使血紅蛋白沉淀下來，SOD溶解在懸濁液中；
6)、將步驟5的懸濁液栗入到壓濾缸中，加壓過濾得到SOD壓濾液900L;最后壓干的血渣可進一步提取氯化血紅素；
7)、將SOD壓濾液栗入到截留分子量為6000D的中空纖維超濾器中，超濾濃縮，得到SOD濃縮液22L;
8)、將SOD濃縮液于60°C水浴中加熱15分鐘，冷卻后離心，去除雜蛋白沉淀，收集SOD熱變液；
9)、將SOD熱變液上樣到預先用平衡液平衡的SepharoseFast Flow色譜柱中(30X10cm(直徑X高度))，再用pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl平衡液平衡10小時，至柱流出液A28q值為0.1以下；用含0.111101/1 NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris-HCl洗脫液洗脫，收集藍綠色SOD色譜帶的下柱液8L;
10)、把SOD下柱液置于50°C的水浴中，用2mo1/L的氫氧化鈉溶液調pH值至9.2，緩慢加入肉豆蔻酰氯液30ml，同時補加2 mol/L的氫氧化鈉溶液，使pH值穩定在9.2左右，反應1.4小時，冷卻后離心，得到修飾SOD液8.08L；
11)、在修飾SOD液中加入1.8倍體積的冷丙酮，攪拌放置后SOD沉淀下來，再離心收集SOD沉淀