一株生產抗氧化肽的蘇云金芽孢桿菌及其篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體設及一株生產抗氧化膚的蘇云金芽抱桿菌及其篩 選方法。
【背景技術】
[0002] 自1956年化rman提出了衰老的自由基理論之后，人們認識到人體內的自由基與人 的衰老和許多疾病有關，因此許多抗氧化劑被應用于保健食品及醫藥等行業。另外，抗氧化 劑能延緩含脂肪食物的腐敗變質，也被用于食品保鮮儲藏。抗氧化劑的種類很多，其中已經 被廣泛使用的多為化學合成類抗氧化劑，由于其有毒、副作用，各國政府嚴格強制控制其添 加量。目前研究較多的是從植物中提取的天然抗氧化活性物質。近年來，人們發現水解蛋白 質得到的膚也具有良好的抗氧化活性。1991年Prokorny提出，一些膚和蛋白水解產物能降 低自動氧化速率和脂肪的過氧化物含量，之后，高活性的蛋白源抗氧化劑成為新的研究焦 點。
[0003] 在水產品加工中會產生許多廢棄蛋白，作為制備抗氧化膚的優良原料采用生物酶 工程和發酵工程等手段生產抗氧化膚，不僅能提高水產品的附加值，而且可W有效降低環 境污染。已經有研究者利用魚類、甲殼類、軟體動物等多種水產品制備出具有抗氧化活性的 活性膚。
[0004] 抗氧化膚的制備方法主要包括提取法、化學水解法、化學合成法、酶法水解和發酵 法等。前Ξ種方法由于提取純化成本高、對活性破壞較大W及副反應產物較多等原因應用 受到了限制;酶法水解反應條件溫和、反應時間短、效率高，是獲得食品級生物活性膚的常 用方法，酶法制備抗氧化膚需要多種酶共同作用，生產成本較高。發酵法是利用微生物發酵 生產抗氧化膚，微生物可對膚的基團進行修飾和重組，制得的膚無異味，可廣泛用于食品和 醫藥行業。微生物發酵法與酶法相比，能將微生物產酶和酶水解兩步合一，減少生產程序， 降低生產成本，更適合大規模生產。雖然近年來有較多相關研究，但迄今沒有一株適合發酵 魚肉等水產品制備抗氧化膚的細菌。
【發明內容】
[0005] 為解決上述現有技術存在的問題，本發明的目的是提供一株生產抗氧化膚的蘇云 金芽抱桿菌及其篩選方法，該菌株的發現，為魚肉等水產品發酵制備抗氧化膚提供了高效 細菌，將微生物產酶和酶水解兩步合一，減少生產程序，降低生產成本，更適合大規模生產。
[0006] 為達到上述目的，本發明所采用的技術方案是：
[0007] -株生產抗氧化膚的蘇云金芽抱桿菌，該蘇云金芽抱桿菌的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[000引一種生產抗氧化膚的蘇云金芽抱桿菌的篩選方法，包括如下步驟：
[0009]步驟一、將腐敗的飯魚肉按l:10(g/v)的比例加入無菌水中，混勻，梯度稀釋后，28 °C條件下培養24小時，涂布在牛肉膏蛋白腺培養基上進行初步分離，用接種環挑取平板上 形態、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，分離后的單菌落在固體酪素培養基上 進行劃線、W單菌落的透明圈直徑與菌落直徑的比值大小進行進一步的分離純化;選取透 明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株進行復篩；
[0010] 步驟二、W牛肉膏蛋白腺培養基、不加蛋白腺液體酪素培養基、不加 k酪氨酸液體 酪素培養基、液體酪素培養基為培養基，對透明圈直徑與菌落直徑比值較大的菌株測定其 酶活力大小;綜合分析W上各方法測定的各株菌，共篩選出酶活力較強的5株細菌；
[0011] 步驟Ξ、將5株細菌經初步鑒定都是芽抱桿菌，純化后的菌株經檢測，測序結果的 核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 進一步的，所述步驟二中，牛肉膏蛋白腺培養基：牛肉膏0.3%、蛋白腺1 %、NaCl 0.5%、瓊脂 2%抑 7.2;
[OOU] 固體酪素培養基：蛋白腺1%、葡萄糖0.1%、酪素〇.5%、NaCl 0.5%、CaCl2 0.01%、L-酪氨酸0.01%、pH7.2、瓊脂2.2%，pH7.2;
[0014] 液體酪素培養基：蛋白腺1 %、葡萄糖0.1 %、酪素0.5%、NaCl 0.5%、 CaCl2〇. 01 %、L-酪氨酸0.01 %、pH7.2。
[0015] 進一步的，所述步驟二中酶活力的測試方法為:福林酪法測定蛋白酶活力:取不同 培養時間發酵液4ml，4°C，lOOOOr/min離屯、30min，得粗酶液;取適當稀釋的粗酶液1ml，30°C 保溫20min，實驗組加入1ml 30°C保溫的2%酪蛋白，對照組加入2ml 0.4mol/LS氯乙酸，混 合均勻，在30°C水浴中準確反應lOmin，實驗組反應后加入2ml 0.4mol/LS氯乙酸終止反 應;對照組加入1ml 30°C保溫的2%酪蛋白，混勻后，靜置lOmin，400化/min離屯、20min。取上 清液1ml，加入5ml 0.4mol/L化C03,并加入1ml酪試劑，搖勻，30°C水浴反應15min，測定 680m處吸光值。
[0016] 相對于現有技術，本發明的有益效果是：
[0017]本發明提供的一株生產抗氧化膚的蘇云金芽抱桿菌Bacillus thuringiensis及 其篩選方法能高效分解低值及水產加工廢棄物并生產抗氧化膚，在大規模利用水產加工廢 棄物方面具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1是Hy4酪素平板培養的菌落形態及透明圈；
[0019] 圖2是Hy-4經齊氏石碳酸復紅染色的結果。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體附圖和實施方式對本發明進行詳細說明。
[0021] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0022] 牛肉膏蛋白腺培養基:牛肉膏0.3%、蛋白腺l%、NaCl 0.5%、瓊脂2%pH7.2;
[0023] 固體酪素培養基：蛋白腺1%、葡萄糖0.1%、酪素0.5%、NaCl 0.5%、CaCl2 0.01%、L-酪氨酸0.01%、pH7.2、瓊脂2.2%，pH7.2;
[0024] 液體酪素培養基：蛋白腺1%、葡萄糖0.1%、酪素0.5%、NaCl 0.5%、CaCl2 0.01 %、L-酪氨酸0.01 %、pH7.2;
[0025]福林酪法測定蛋白酶活力：取不同培養時間發酵液4ml，4°C，10000r/min