一種基于肥大細胞-巨噬細胞共培養微流控芯片的構建及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種基于肥大細胞-巨噬細胞共培養微流控芯片的構建及其應用，屬于食品質量分析檢測領域。
【背景技術】
[0002]食物過敏原是指食物中能引起機體免疫反應的抗原分子，水產品作為人類重要的食源性蛋白質的主要來源，其中蝦、蟹等甲殼類水產品所引起的過敏癥在臨床反應中最為常見。食品過敏癥是在全世界范圍內廣泛流行的一類常見變態反應性疾病，其具有癥狀種類繁多、病癥情況復雜、危害廣泛、難以徹底根治的特點，長期以來一直都是困擾醫學界的一大難題。近年來，在全世界范圍內，隨著食品過敏癥的發病率不斷上升，對食物過敏的預防和檢測已經成為一項迫切的需求，但由于目前尚無有效治療食物過敏癥的方法，而避免進食含有致敏原的食物是唯一的預防手段，因此建立一種或多種靈敏檢測過敏原的分析方法顯得尤為重要。
[0003]現有檢測過敏病癥的方法主要分為以下兩大類:體內檢測和體外檢測。雖然體內檢測對醫生或是病人來說都是最方便可靠的方法，但是其潛在的風險無法忽視，需要謹慎對待。在我國，對過敏原的體外檢測尚未得到大力重視，傳統的診斷模式依舊在使用，這不但不利于對過敏疾病的及時確診和治療，也會給病人帶來額外的身心痛苦。由于過敏原種類眾多，且因同個體而多變化，因此建立多種快速靈檢測過敏原的方法來取代體內試驗成為迫切需要。
[0004]細胞是形成有機體形態和功能的基本組成單位，對研究機體結構和探索生命活動具有重要意義。細胞傳感技術以活細胞作為探測元件，通過對活細胞的基本生理性質或細胞對被測物的響應進行檢測，從而定性定量地確定細胞的生理狀態或被檢物的含量。因此，細胞傳感技術對于研究細胞的結構和功能、探索生命的活動和規律、疾病的診斷和治療、藥物的設計和篩選、食品安全的監督和檢測等都具有十分重大的意義。隨著生命工程技術的發展與信息技術的飛躍，各學科間的交叉融合，使得細胞傳感檢測研究得到了飛速發展，新型的納米材料、熒光及電化學細胞傳感器不斷問世，極大推動了生物傳感技術地迅猛發展。
[0005]近年來，微流控細胞芯片己被廣泛運用于臨床檢測和疾病治療領域，通過在微型芯片上集成多種功能單元，可實現對被檢樣品的完整檢測，包括進樣、反應、分離、輸出等操作。早在1998年，Whitesides等就提出了采用軟光刻技術在聚二甲基硅氧烷(PDMS)基礎上制備微流控芯片的想法，并開發了多層微流通道實現了微流栗、閥等對微流體的良好控制。相比傳統的分析方法，微流控芯片具有樣品量需求量少，污染小，響應時間短，分析效率高的特點。此外PDMS材料透明便于觀察，有利于精確控制實驗過程，滿足批量化生產和高通量的需求。固定有細胞的微流控芯片能在細胞和分子水平上對細胞活動(如細胞增殖生長、固定迀移、內吞外排、藥物作用)等進行分析。
【發明內容】
[0006]針對現有技術存在的上述不足，本發明建立了肥大細胞與巨噬細胞共培養體系(二維細胞)的PDMS微流控芯片平臺，成功應用于食品過敏原識別評價研究。本發明實現肥了大細胞與巨噬細胞共培養體系(二維細胞)的PDMS微流控芯片平臺。采用特殊流道設計，采用“張力閥道”實現了對兩種細胞的非直接接觸共培養，從而能夠精確控制兩種細胞共培養過程，從而有效的研究細胞旁分泌機制，以及通過在PDMS基底表面電鍍金電極，借助電化學阻抗信號對共培養中細胞的生理活動實時監測。通過以上設計，構建了用于食品過敏原識別評價研究的細胞共培養微流控芯片平臺。
[0007]本發明的第一個目的是提供一種PDMS微流控芯片，所述TOMS微流控芯片的主要結構一 PDMS流道層，由兩條平行等長的主通道構成，通道兩端設有插槽以便注入液體;兩條主通道通過一條毛細管道垂直聯通。
[0008]所述PDMS微流控芯片是將電化學技術與微流控芯片相結合設計得到的，由PDMS流道層和鍍金硅片層這兩部分組成;所述毛細管道的兩端設計有插孔，用于插入微型參比電極;每一條主通道底面電鍍一枚金電極;所述I3DMS微流控芯片還包括鍵合在PDMS流道層下的鍍金硅片層，鍍金硅片層表面電鍍四組金電極(如圖2)，每個工作電極的引導線將工作電極和芯片邊緣的金手指(供電極夾固定)相連接，在工作電極的前方是半圈電鍍金層作為對電極，其也由電鍍導線連接到芯片邊緣的金手指上;所述微流控芯片的TOMS流道層與鍍金硅片層鍵合在一起構成完整芯片。
[0009]所述?015流道層全長44670.83口111、寬3120(^111、厚4111111，由2條寬100(^111，長31673.16μπι的平行主通道構成;每條主通道的兩端是直徑為2500μπι的插槽，通過該插槽細胞懸液、培養液、以及致敏藥物能夠由此注入兩條主流道中；兩條主通道中間是有一條直徑為ΙΟΟμπι、長ΙΟΟΟΟμπι的張力閥道，即毛細管道。
[0010]所述PDMS微流控芯片是將電化學技術與微流控芯片相結合設計得到的；在毛細管道兩端設計出直徑為2000μπι的插孔，用于插入微型Ag/AgCl參比電極;每一條主通道底面電鍍一枚金電極;在PDMS流道層下鍵合有鍍金硅片層，鍍金硅片層電鍍四組金電極，每個工作電極的直徑為ΙΟΟΟμπι，直徑為500μπι引導線將工作電極和芯片邊緣寬為4000μπι的金手指相連接，在工作電極的前方是半圈寬為100ym的電鍍金層作為對電極，對電極也由寬500μπι的電鍍導線連接到芯片邊緣的金手指上;將PDMS流道層與鍍金硅片層鍵合在一起構成完整得到PDMS微流控芯片。
[0011 ]所述PDMS微流控芯片中，當兩條主通道內同時同向等速流動細胞懸液或者培養液時，毛細管道的兩端因為壓力相同，使平行的兩條主通道連通;而當平行主通道的其中一個主通道停止栗入流體，則另一個主通道內的液體就會通過毛細管道流入該通道內，從而實現兩平行主通道的聯通。即當壓力相同時，兩條主通道自己連通;而壓力不同時，一條主通道的液體通過壓力差流過毛細管通道流入另一個通道。
[0012]本發明的第二個目的是提供一種細胞共培養的方法，是利用所述PDMS微流控芯片進行共培養。
[0013]在本發明的一種實施方式中，所述細胞共培養，是指共培養肥大細胞和巨噬細胞。
[0014]在本發明的一種實施方式中，所述細胞共培養，是將RBL-2H3肥大細胞和ANA-1巨噬細胞先在培養皿中培養2-3天，使細胞處于對數生長期，然后再用于芯片上培養。
[0015]在本發明的一種實施方式中，所述芯片上的培養，是使用注射器分別吸取肥大細胞懸液和巨噬細胞懸液、拍氣泡，然后定速控制(速度一般控制在200yL/h?0.lmL/h)，使兩個注射器中的細胞懸液以相同流速注入芯片中，當芯片兩條通道內注滿兩種細胞懸液后，同時停止兩臺注射栗的運作，將芯片放入CO2培養箱中孵育6小時(保證細胞的貼壁，防止培養基的流動沖刷對細胞生長的影響)，然后將注射器更換為不含細胞的新鮮培養液(用于肥大細胞的為DMEM、巨噬細胞的為RPM1-1640)，再使注射器中培養液同時啟動兩臺注射栗持續栗入(端口不封閉)，以相同流速繼續培養細胞。
[0016]在本發明的一種實施方式中，所述芯片上的培養，當需要研究巨噬細胞與肥大細胞的相互作用時，在培養箱中孵育后，只啟動兩臺栗中的一臺(另一端封閉)，即研究巨噬細胞對肥大細胞影響時只啟動巨噬細胞一端的栗，反之則只啟動肥大細胞一端的栗，從而使一條流道內的細胞代謝物隨著液體通過張力閥流入另一條細胞流道內，達到共培養的目的。
[0017]在本發明的一種實施方式中，所述PDMS微流控芯片進行共培養，指經高壓滅菌和紫外照射后的微流控芯片，用5ml注射器吸取細胞懸液后并架設在XSPOl注射栗上，采用安裝在筆記本上的操作程序控制栗的運作，調節栗的流速將細胞懸液注入到微通道中；待注射栗將細胞懸液把細胞芯片的流道充滿時，停止栗的流速，將芯片放置于CO2培養箱中孵育6小時，保證細胞的貼壁，防止培養基的流動沖刷對細胞生長的影響。待細胞完全貼壁之后，將內裝不含細胞的新鮮培養液的注射器栗連接芯片一端的進口，并使用電腦軟件調節一定的流速，向芯片內連續不斷的供給培養液，從而達到連續培養的目的。
[0018]本發明的第三個目的是提供所述PDMS微流控芯片在食品過敏原檢測方面的應用。
[0019]所述應用，是在PDMS微流控芯片中的巨噬細胞和肥大細胞共培養體系、巨