紅藻龍須菜多糖及其制備、抗腫瘤活性檢測方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種大型海藻來源的多糖、其制備方法、抗腫瘤活 性的檢測方法及應用，具體涉及一種紅藻龍須菜多糖的提取和純化、其制備方法、其抗腫瘤 活性的檢測方法及其在抗腫瘤藥物制備或作為增效劑的用途。
【背景技術】
[0002] 隨著人口老齡化加劇、生態環境遭受破壞、不健康生活方式及食品安全問題等凸 現，腫瘤發病率和死亡率持續上升，給人們生活、健康及社會帶來嚴重危害。常見的腫瘤藥 物及放療、化療等治療方法效果好但副作用較大。中醫單獨或輔助西藥治療腫瘤在提高機 體免疫力、延長生存期、降低復發轉移率及減輕副作用等方面有著積極的意義。從研制創新 藥物角度出發，海洋藥物的研究是開發以傳統中藥為來源的新型天然活性藥物的熱點及重 要方向之一。《中草藥大辭典》載藥5767味，其中海洋藥物144種（128味）；《中國海洋藥物辭 典》收錄海洋藥物1600條，其中海洋藻類藥物125條。美國國立腫瘤研究所每年篩選30，000 個新的抗腫瘤化合物，約5%來自海洋生物。目前國內外關于海藻抗腫瘤藥物的報道日益增 多，我國海域遼闊，海藻資源豐富，利用藻類生產抗腫瘤物質很有潛力。如果能將資源豐富 的海藻開發為抗腫瘤藥物，必將降低新藥研制和開發的成本。
[0003] 龍須菜(Gracilariopsis Iemaneiformis)是紅藻門、真紅藻綱、杉藻目、江蘺科、 江蘺屬大型海藻，主要分布于我國山東、遼寧、江蘇、福建、海南等沿海地區，具有適應范圍 廣、生長快、含膠量高、適應環境能力強和營養價值高等優點。明代李時珍在《本草綱目》中 指出:龍須菜可以治癭結熱氣，利小便。因此，龍須菜對人體有著極為重要的保健功效，且營 養價值高，是"下八珍"的一珍。龍須菜性味甘、寒，主要入肝經，具有助消化、解積膩、清腸胃 和止血降壓、軟堅化痰、清熱利水、溫經止痛的功效。龍須菜富含活性多糖、藻紅蛋白及膳食 纖維和營養元素等，具有免疫調節活性、降血脂、抗氧化、抗凝血、抗病毒、抗菌、抗炎鎮痛等 多種生物學活性和藥用保健功效，而且具有毒性小、藥源豐富的特點。
[0004] 鑒于龍須菜是一種容易獲得且生長快的海洋藻類資源，為了充分利用這種藻類資 源，本領域技術人員致力于進一步開拓其生物活性物質的用途。
【發明內容】
[0005] 為了進一步開拓龍須菜的生物活性物質的用途，本發明的一個方面提供了一種多 糖，其來自紅藻類植物龍須菜，為981品種。
[0006] 本發明的另一方面，提供了一種龍須菜多糖在制備治療腫瘤藥物的增效劑中的應 用。
[0007] 進一步地，治療腫瘤藥物的增效劑是指上述龍須菜多糖與抗腫瘤藥物順鉑聯用， 能提高順鉑的抗腫瘤作用。
[0008] 進一步地，上述藥物包括龍須菜多糖和藥學上可接受的酸、堿、鹽、水合物或酯及 其他輔料。
[0009] 本發明的又一方面，提供一種龍須菜多糖在制備治療腫瘤的藥物、保健品或食品 中的應用。
[0010] 進一步地，上述腫瘤為胃腺癌、肺癌或子宮頸癌。
[0011] 本發明的再一方面提供一種制備上述龍須菜多糖的方法，包括以下步驟：
[0012] 1)用水溶解龍須菜干粉，并用NaOH調節溶液pH至9-11，離心獲得第一上清液和第 一沉淀；
[0013] 2)在步驟1)中離心得到的第一沉淀中加入水溶解，并用NaOH調節溶液pH至9-11， 并再次離心，獲得第二上清液；
[0014] 3)合并第一上清液和第二上清液，并加入三氯乙酸進行沉淀，離心獲得第三上清 液；
[0015] 4)在第三上清液中加入無水乙醇進行沉淀，離心獲得第二沉淀；
[0016] 5)用丙酮洗滌第二沉淀，并冷凍干燥，獲得粗提龍須菜多糖；
[0017] 6)將步驟5)中的粗提龍須菜多糖溶于水，通過離子交換柱進行分步洗脫，真空干 燥后獲得純化的龍須菜多糖。優選地，離子交換柱為DEAE Sephadex A-25離子交換柱;用蒸 餾水、0.3mol/L NaCl和1.2mol/L NaCl溶液進行分步洗脫;分步洗脫后獲得3種級分，將最 顯著的級分作為純化的龍須菜多糖進行后續實驗。
[0018] 優選地，步驟1)和步驟2)中，用NaOH調節溶液pH至10。
[0019]進一步地，步驟3)中加入的三氯乙酸的質量濃度為2%_5%。優選三氯乙酸的質量 濃度為3 %。
[0020]本發明的又一方面提供一種檢測上述龍須菜多糖抗腫瘤活性的方法，包括：
[0021 ] 1)將腫瘤細胞接種到新鮮培養基中，培養至對數生長期，并制成細胞懸液，接種至 多孔板中；
[0022] 2)待細胞貼壁后，將培養基替換為含有不同濃度的龍須菜多糖的培養基，并繼續 培養24小時、48小時或72小時；
[0023] 3)將步驟2)中的培養基替換為含有CCK-8的培養基，繼續培養后檢測吸光度值；
[0024] 4)計算所述龍須菜多糖作用不同時間段對腫瘤細胞的增殖活力的影響，確定IC50 值。
[0025]進一步地，上述CCK-8的終濃度為8%-12%，檢測波長450nm的吸光度值。優選的， 〇〇(-8的終濃度為10%。
[0026] 進一步地，上述腫瘤細胞為胃腺癌細胞MKN45、肺癌細胞A549和宮頸癌Hela細胞。
[0027] 本發明采用的龍須菜富含活性多糖，其龍須菜多糖作為海洋藥物資源，具有良好 抗腫瘤效果，主要能夠通過抑制腫瘤細胞的生長和增殖來發揮其抗腫瘤的作用，同時沒有 明顯的毒副作用。尤其是對人胃癌、肺癌、子宮頸癌和白血病等腫瘤均有良好的抑制作用， 其中又以對肺癌的抗腫瘤作用最明顯，且這種抑制作用在一定濃度范圍內具有時間-濃度 依賴性。另外，將龍須菜多糖與用于治療多種實體瘤的一線用藥順鉑聯合使用，能夠增強對 順鉑的抗腫瘤作用，尤其是對肺癌的抗腫瘤作用的增效作用顯著。
[0028] 龍須菜多糖抑制腫瘤細胞的生長和增殖這種雙重作用有利于腫瘤病人的綜合治 療和康復，適于聯合用藥，具有廣闊的應用前景。龍須菜多糖作為一種新型的抗腫瘤多糖， 有望成為預防和治療惡性腫瘤的輔助藥物，值得進一步研究和開發成藥用多糖或保健品多 糖或者相關食品，以提高龍須菜的經濟利用價值。
[0029] 以下將結合附圖對本發明的構思、具體步驟及產生的技術效果作進一步說明，以 充分地了解本發明的目的、特征和效果。
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發明的一個較佳實施例的龍須菜多糖的提取、純化的結果圖。
[0031] 圖2是本發明的一個較佳實施例的龍須菜多糖對胃腺癌MKN45細胞生長和增殖的 抑制作用圖。
[0032]圖3是本發明的一個較佳實施例的龍須菜多糖對肺癌細胞A549細胞生長和增殖的 抑制作用圖。
[0033] 圖4是本發明的一個較佳實施例的龍須菜多糖對子宮頸癌Hela細胞生長和增殖的 抑制作用。
【具體實施方式】
[0034] 本發明中使用的各種試劑，除了有特別標注，均可以直接購買獲得。
[0035]本發明的龍須菜多糖是從一類紅藻類植物龍須菜（Gracilariopsis Iemaneiformis)中提取并初步純化得到的多糖。龍須菜為981品種，采自浙江溫州。
[0036]實施例1龍須菜多糖的提取及純化
[0037]提取:龍須菜于2014年10月采自浙江溫州，經反復清洗、去除泥沙等雜物，陰干粉 碎，保鮮袋冷藏保存。稱取100g龍須菜干粉，加入700mL CldH2O，用NaOH中和調節pH至10。在 80°C的水浴中保溫4小時，期間進行間歇性地攪拌。將上述溶液于8000rpm/min離心15min， 取上清液。為減少多糖損失，在沉淀中再加入5mL ddH20，并用NaOH調節pH至10，在80°C水浴 中保溫4小時，期間進行間歇性地攪拌，然后將溶液于8000rpm/min離心15min，再次取上清 液。將第一次和第二次離心獲得的上清液合并以提高多糖提取率，用草酸調節pH至7,在多 糖水提液中滴加3%與多糖水提取液等體積的三氯乙酸(Trichloroacetic acicUTCA)，混 勻，于25°C靜置lh，將TCA沉淀后的溶液于8000rpm/min離心15min后除去膠狀沉淀，得到無 蛋白質的多糖。用丙酮洗滌沉淀2次，冷凍干燥得到白色粉末狀粗提龍須菜多糖。
[0038]純化:將上述方法提取的粉末狀粗提多糖復溶于水，取3ml樣品過DEAE Sephadex A-25離子交換柱，用蒸餾水和3mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫，流速0.5ml/min，每管5ml收 集100管，用蒽酮一硫酸法測定每管多糖濃度。在此基礎上，再用蒸餾水、〇.3mol/L NaCl和 1.2mol/L NaCl溶液分步洗脫，流速0.5ml/min，每管5ml收集，將含糖量較高的洗脫液減壓 濃縮后，透析去鹽，真空干燥得到各多糖組分。結果顯示：利用DEAE-Sephadex A-25離子交 換柱進行分步洗脫，可以得到3個明顯的吸收峰（圖1)，表明本發明的這個實施例中提取及 純化獲得的龍須菜多糖至少含有3種級分。收集這3種級分，依次命名為P-I、P-2和P-3,3種 級分占上樣量的比率分別3.56%、69.37%、18.29%。將上述真空干燥后獲得的最顯著的級 分P-2加入CldH 2O配成lmg/mL母液，過濾除菌，分裝，4°C保存備用，以此進行抗腫瘤活性檢 測。
[0039]實施例2龍須菜多糖對胃腺癌細胞MKN45生長和增殖的抑制作用
[0040]胃腺癌細胞MKN45為貼壁細胞，細胞復蘇后以5