組蛋白電泳和Western Blot鑒定圖。左邊Marker泳道為 DNA分子量標準，泳道1中的菌落PCR片段出現在預期位置。中間為純化后的蛋白進行SDS-PAGE檢測，在預期位置出現明亮條帶。右邊為以抗PSMA單克隆抗體和抗His標簽抗體的 Western Blot鑒定圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面通過單域重鏈抗體(多肽)的制備、分析及應用，對本發明做進一步說明，這些 具體實施例不應以任何方式被解釋為限制本發明的應用范圍。
[0026] 實施例1
[0027] 前列腺特異性膜抗原膜外區的真核表達
[0028] 采用RNAiso Plus試劑提取高表達PSMA的LNCaP細胞中總RNA，利用RT-PCR方法得 到編碼PSMA胞外區片段的DNA片段，使用Not I與BamH I兩種限制性內切酶將其插入真核表 達載體pRAG2a，通過T4DNA連接酶連接為重組質粒。重組質粒熱擊轉化到TOP 10感受態細胞 培養過夜，將鑒定正確的克隆送測序驗證。提取陽性克隆的質粒，使用脂質體 Lipofectamine 2000將DNA質粒轉染至HEK-293細胞中培養，于不同時相點收集上清，進行 SDS-PAGE電泳檢測。培養一定時間后，按照HisTrap FF Crude試劑盒操作純化該蛋白。將純 化后的蛋白進行SDS-PAGE后，電轉至PVDF膜上，5 %脫脂奶粉封閉后，分別加入PSMA抗體和 His抗體，4°C過夜;漂洗后，加二抗室溫下孵育Ih，再次漂洗，加入顯色液進行顯影(圖1)。 [0029] 實施例2
[0030]抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體（即針對抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗 體)的淘選與鑒定
[0031]采用固相淘選的方法從駝源天然抗體噬菌體展示文庫(為參考文獻："涂追，許楊， 劉夏，等.駝源天然單域重鏈抗體庫的構建與鑒定[J].中國生物工程雜志，2011，31 (4): 31 -36."中構建的展示文庫）中淘選針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體。前列腺特異性 膜抗原膜外區的表達按照上述的實施例1進行，第一輪淘選時，采用磷酸鹽緩沖溶液(PBS， pH7.4)稀釋上述合成的PSMA胞外區蛋白至150yg/mL (第2-4輪包被濃度分別為100、50、50μ g/mL)，在酶標板上每孔加入IOOyL，4°C包被過夜。PBST (合0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37°C封閉2h，洗板3次，加入與0.5%BSA-PBS孵育過的噬菌體抗體庫IOOyL(約合2 X IO11CFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐輪增加3次），再用PBS洗板10次(逐輪增加5次）。 再以IOOyL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附的噬菌體(37°C，5min)，用50yLTris-HCl (lmol/L，pH 9.0)中和洗脫物，取IOyL用于滴度測定，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。 [0032]經過四輪淘選后采用濃度為5yg/mL的PSMA胞外區蛋白包被酶標板，洗板、封閉同 上。加入擴增純化的噬菌體克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀釋度 為1:5000的HRP-anti-M13抗體，IOOyL/孔，37°C孵育 Ih JBST洗板5次，加 TMB工作液IOOyL/ 孔，室溫20min，每孔加入50yL硫酸(濃度為2mol/L)終止反應，測定450nm吸光值。以前一輪 擴增的噬菌體抗體庫直接包被酶標板作為陽性對照，以PBS替代噬菌體克隆為空白對照，用 間接phage-EL ISA法測定菌體顆粒的結合活性。
[0033] 表1間接phage-ELISA加樣表
[0035] 將ELISA陽性克隆送測序公司進行序列測定，得到抗前列腺特異性膜抗原單域重 鏈抗體噬菌體陽性克隆的插入片段DNA序列，具體為(SEQ ID NO. :2):
[0036] ATGGCCCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCCCTAAGACTCACCTGTACAAC CTCTGGATTCAGTTTGAGATATCATGACATCGGTTGGTTCCGCCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCTCAT GTATTACTGGGAGCCTCGGTGACCCCTACGTTGACGAGTCCCTACAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACGACCAC AAGAATATGGTGTATCTGCGAATGAACAGCCTGAAATCTGAGGACACGGCCCTTTATTATTGCGCGATAGTGCGCGG GTGCAAGGACCATGACGCGTACGCAGACGTGCGAGCCCGGGGCCAGGGGACGCAGGTCACCGTCTCCTCGGAACCCA AGACACCAAAACCACAAGCGGCCGCA其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.:1 所示：
[0037] QLQLVESGGGLVQPGGSLRLTCTTSGFSLRYHDIGWFRQAPGKEREGVSCITGSLGDPYVDESLQGRFTISRDDHKN MVYLRMNSLKSEDTALYYCAIVRGCKDHDAYADVRARGQGTQVTVSS。即本發明抗前列腺特異性膜抗原 的單域重鏈抗體，其能與PSM蛋白的膜外區發生特異性結合。
[0038] 實施例3
[0039] PSMA表達細胞的ELISA和熒光免疫檢測
[0040] 胃癌細胞MKN45不表達PSMA，而前列腺癌細胞LNCaP表達PSMA，以這兩種細胞為例， 采用實施例2中淘選獲得的抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆進行細胞 水平的ELI SA和熒光免疫檢測。向96孔板中分別種入LNCaP細胞(表達PSM)和MKN45細胞(不 表達PSMA)各I X IO4個，培養過夜。4%多聚甲醛固定，每孔滴加 IOOyL的3%過氧化氫液，用 以阻斷內源性過氧化物酶活性，37°C孵育30min JBS洗板3次，5 %BSA-I3BS封閉，加入IOOyL 抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆，于37°C孵育lh。其后PBS漂洗，添加 HRP-ant i -Ml 3抗體、TMB工作液和OD45Q的測定同實施例2。陽性對照使用噬菌體替代細胞，空 白對照使用PBS替代添加的噬菌體克隆，重復3次。
[0041 ]向24孔板中的每孔中添加細胞爬片后種入LNCaP細胞和MKN45細胞各4X IO5個，培 養過夜。取出爬片，4%多聚甲醛固定，漂洗，滴加3%過氧化氫在爬片表面，用以阻斷內源性 過氧化物酶活性。其后TBS洗3次，5 % BSA-PBS封閉30min。滴加 IOOyL展示本發明所述納米抗 體的噬菌體克隆孵育lh，以不加噬菌體克隆的細胞爬片為空白對照。其后添加稀釋度為1: 2000的anti-M13單克隆抗體孵育30min。洗片后滴加30μ1稀釋度為1: 200的FITC-山羊抗小 鼠二抗，避光孵育30min，并用DAPI染色液進行復染，置于熒光顯微鏡下觀察。
[0042] 結果表明：由于不表達PSMA的MKN45細胞測值在統計學上與空白對照存在差異，表 明該噬菌體能夠與其發生非特異性結合;但是LNCaP細胞測值顯著高于MKN45細胞，表明這 一部分差異來自于PSMA和抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆的特異性 結合。同時，細胞免疫熒光表明LNCaP細胞能夠與針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體 陽性克隆結合，而MKN45細胞以及未加抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克 隆的細胞爬片為陰性，表明淘選出的抗前列腺特異性膜抗原單域重鏈抗體噬菌體陽性克隆 能夠有效地與PSM表達陽性的細胞發生特異性結合。
[0043] 實施例4
[0044] 抗前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體在大腸桿菌中的表達
[0045] 提取實施例2中針對前列腺特異性膜抗原的單域重鏈抗體陽性克隆的噬菌粒為模 板，設計特異性引物擴增目的基因，擴增條件:94°C5min預變性;94°C30s、55°C30s、72°C40s 共30個循環；最后72°C再延伸5min。結束后用1%瓊脂