一種單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗豬圓環病毒2型單克隆抗體、含該單克隆抗體的藥物組合物、抗體檢 測試劑盒、抗原檢測試劑盒等應用，屬于生物醫藥領域。
【背景技術】
[0002] 豬圓環病毒（Circoviridae，Circovirus，Porcine circovirus，PCV)是迄今發現 的一種最小的動物病毒，病毒直徑約17nm，環狀，單股DNA病毒，具有兩個血清型即PCVl和 PCV2。其中，PCVl沒有致病性；PCV2具有致病性，可引發一系列豬圓環病毒病（Porcine Circovirus diseases，PCVD)包括斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Postweaning Multisystcmic Wasting Syndrome，PMWS)、仔豬A2型先天震顫(A2CT)、豬繁殖障礙、豬皮炎 腎炎綜合征(PDNS)、增生性壞死性肺炎(PNP)和呼吸道疾病綜合征(PRDS)，特別是PMffS的主 要病原。PMWS主要侵害6-8周齡的仔豬，發病率一般為10 %-20 %，病死率高達50 %-100%， 并能造成免疫抑制降低抗病力;成年豬一般為隱性感染，不表現任何癥狀，但可以傳染給仔 豬。這些疾病的廣泛流行嚴重影響了養豬業的發展，給許多國家和地區帶來了巨大的損失。
[0003] 目前，PCV2抗體的檢測方法包括免疫過氧化物酶單層試驗（IPMA)、間接免疫熒光 試驗(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，但IPMA、IFA不能區分PCVl和PCV2的抗原交叉反應， 且操作復雜，耗時耗力；現有ELISA試劑盒包括國外試劑盒(荷蘭Biochek公司的PCV2ELISA SKl 05、韓國金諾公司的PCV2ELISA)和國內試劑盒（以間接ELI SA抗體檢測試劑盒為主，如中 國動物衛生與流行病學中心的PCV2ELISA抗體檢測試劑盒、浙江大學的PCV2-dCap-ELI SA抗 體檢測試劑盒），這些試劑盒均不能區分PCVl交叉抗體的問題。
[0004] 臨床上，PCVl與PCV2經常混合感染，雖然PCVl不會引起發病，但會交叉干擾PCV2感 染的檢測。免疫學試驗表明，PCVl病毒與PCV2病毒有明顯發交叉反應。因此，檢測PCV2感染 的關鍵技術在于如何盡可能地排除PCVl的干擾，減少假陽性結果。鑒于此，為了更為準確地 檢測PCV2,亟需建立一種檢測方法。
【發明內容】
[0005] 為了解決現有技術的不足，本發明提供了一種抗豬圓環病毒2型單克隆抗體及其 應用，該單克隆抗體可用于檢測豬圓環病毒2型抗體、抗原，還可以預防和/或治療豬圓環病 毒病。
[0006] 本發明涉及一種特異性結合豬圓環病毒2型的單克隆抗體PCV2_McAB2的可變區序 列，其中，1)重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或該序列經過一個或 多個氨基酸添加、刪除、替換或修飾保守性突變獲得的保守性變異體;2)輕鏈可變區氨基酸 序列為SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或該序列經過一個或多個氨基酸添加、刪除、替換或 修飾保守性突變獲得的保守性變異體。
[0007] 本發明還涉及具有上述可變區序列的抗體或其片段，所述抗體或其片段仍保持特 異性結合豬圓環病毒2型的能力。
[0008] 本發明還涉及一種藥物組合物，所述藥物組合物包括免疫量的含有所述單克隆抗 體PCV2-McAB2可變區序列的抗體或所述抗體片段，以及藥學上可接受的載體。
[0009] 本發明還涉及所述藥物組合物在制備預防和/或治療豬圓環病毒2型感染相關疾 病的藥物中的應用。
[0010] 本發明還涉及一種抗體檢測試劑盒，所述抗體檢測試劑盒包括有效量的具有所述 單克隆抗體PCV2-McAB2的可變區序列的抗體或所述抗體片段，豬圓環病毒2型抗原，以及用 于對豬圓環病毒2型的抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0011] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，所述抗原檢測試劑盒包括有效量的抗豬圓環 病毒2型單克隆抗體PCV2-McABl和/或有效量的具有單克隆抗體PCV2-McAB2的可變區序列 的抗體或所述抗體的片段，以及用于對豬圓環病毒2型抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑、 陰性對照、陽性對照;其中，所述單克隆抗體PCV2-McABl為2F8或3G12。
[0012] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括抗豬圓環病 毒2型單克隆抗體PCV2-McABl和/或有效量的具有單克隆抗體PCV2-McAB2的可變區序列的 抗體或所述抗體的片段，以及用于對豬圓環病毒2型進行抗原抗體反應進行檢測的檢測試 劑、陰性對照、陽性對照，其中，所述用于對豬圓環病毒2型進行抗原抗體反應進行檢測的檢 測試劑為與所述抗體或所述抗體的片段結合的酶標二抗以及與所述標記的酶產生顏色反 應的底物，所述酶標二抗包括酶標羊抗鼠多抗、酶標羊抗鼠二抗。
[0013] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括有效量的所 述單克隆抗體PCV2-McABl、有效量的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,以及用于對豬圓環病毒2 型進行抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑;其中，所述抗原檢測試劑盒包括緩沖液供應單 元和酶免疫層析檢測試紙條;所述緩沖液供應單元用于將緩沖液供給所述酶免疫層析檢測 試紙條;所述酶免疫層析檢測試紙條包括硝酸纖維素膜(1 )，所述酶免疫層析檢測試紙條在 縱向上依次包括底物供應區、樣品供應區、檢測區;所述底物供應區包括底物墊(3)，其上吸 附有干燥的酶底物，所述底物墊(3)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述酶底物溶于緩沖液中并 在硝酸纖維素膜（1)上向距所述緩沖液供應單元的遠端迀移;所述樣品供應區包括酶標墊 (2)，其上吸附有酶標記的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,所述酶底物能與所述單克隆抗體 PCV2-McAB2上標記的酶產生顯色反應，所述酶標墊(2)與硝酸纖維素膜（1)接觸，所述單克 隆抗體PCV2-McAB2溶于緩沖液中并在硝酸纖維素膜(1)上向距所述緩沖液供應單元的遠端 迀移；以及所述檢測區固定化有所述單克隆抗體PCV2-McABl;其中，所述緩沖液供應單元包 括展開液墊(5 )、底物緩沖液槽(8 )、底物緩沖液(9)和緩沖液按鈕，所述底物緩沖液(9)放置 于底物緩沖液槽(8)中，所述緩沖液按鈕位于底物緩沖液槽(8)的上方，按下可將所述展開 液墊(5)浸入緩沖液(9)中；所述檢測區包括一條檢測線(6)、一條質控線(7)，其中，所述質 控線(7)較檢測線(6)更遠離所述樣品供應區，在所述檢測線(6)上固定化有所述單克隆抗 體PCV2-McABl，在所述質控線（7)上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗，且吸附在酶標墊 (2)上的酶標記的所述單克隆抗體PCV2-McAB2對于固定在檢測線(6)上的所述單克隆抗體 PCV2-McABl而言是過量的；所述硝酸纖維素膜（1)全段粘附在所述支撐物（10)上，支撐物 (10)連接所述緩沖液供應單元，底物供應區，樣品供應區，檢測區以及吸水墊(4)，所述吸水 墊(4)在距所述緩沖液供應單元的最遠端；以及檢測樣品（11)加入的位置為所述酶標墊(2) 的位置。
[0014] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括有效量的所 述單克隆抗體PCV2-McABl、有效量的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,以及用于對豬圓環病毒2 型進行抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑;其中，所述抗原檢測試劑盒包括膠體金檢測試 紙條，所述膠體金檢測試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端 向第二端的方向上依次有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述硝酸纖維素 膜與金標墊接觸或與樣品墊、金標墊接觸使得抗原與所述單克隆抗體PCV2-McAB2的結合體 能在其上向底板第二端迀移；所述金標墊上含有膠體金標記的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,所述硝酸纖維素膜上近所述底板第二端的位置包括一條檢測線和一條質控線，所述 檢測線上固定化有所述單克隆抗體PCV2-McABl，所述質控線上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗 鼠多抗。
[0015] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括有效量的所 述單克隆抗體PCV2-McABl、有效量的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,以及用于對豬圓環病毒2 型進行抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑;其中，所抗原檢測述試劑盒包括熒光免疫檢測 試紙條，所述熒光免疫檢測試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第 一端向第二端的方向上依次由濾紙、樣品墊、熒光墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述硝酸纖 維素膜與熒光墊接觸或與樣品墊、熒光墊接觸使得與抗原與所述單克隆抗體PCV2-McAB2的 結合體能在其上向底板第二端迀移;所述熒光墊上含有熒光標記的所述單克隆抗體PCV2-McAB2,所述硝酸纖維素膜上包括一條檢測線和一條質控線，所述檢測線上固定化有所述單 克隆抗體PCV2-McAB 1，所述質控線上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗。
[0016] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括包被所述單 克隆抗體PCV2-McABl的ELISA板、含酶標記所述單克隆抗體PCV2-McAB2的反應液、對豬圓環 病毒2型進行抗原抗體反應進行檢測的檢測試劑、陰性對照、陽性對照。
[0017] 本發明還涉及一種抗原檢測試劑盒，其中，所述抗原檢測試劑盒包括包被豬圓環 病毒2型抗原的ELISA板、含所述單克隆抗體的反應液、洗滌液、稀釋液、底物顯色液、終止 液、陰性對照、陽性對照；其中，含所述單克隆抗體的反應液為含所述單克隆抗體PCV2-McAB2的反應液、或含所述單克隆抗體PCV2-McABl與PCV2-McAB2的混合反應液。
[0018] 本發明還涉及所述抗原檢測試劑盒在用于非診斷目的的豬圓環病毒2型抗原檢測 中的應用。
[0019] 本發明的有益效果:含本發明單克隆抗體PCV2-MCAB2的抗體檢測試劑盒不與PCVl 抗體交叉反應，降低了假陽性檢出率，同時相對于IPMA、IFA等需要花費4-5天的檢測方法， 該檢測方法花費2小時，縮短了檢測時間;含本發明單克隆抗體PCV2-McAB2的抗原檢測試劑 盒可用于非診斷目的的豬圓環病毒2型抗原檢測中的應用，減少了假陽性結果;含本發明的 抗豬圓環病毒2型單克隆抗體的藥物組合物可解決母源抗體不足時所引發的豬圓環病毒感 染的問題，可彌補現有疫苗預防效果不能達到100%的缺陷，解決了現有疫苗、母源抗體不 足時所引發的仔豬豬圓環病毒2型感染問題;單克隆抗體PCV2-McAB2具有中和病毒的活性， 能夠用于相關聯苗的鑒別檢驗。
【附圖說明】
[0020] 圖1為單克隆抗體3H11的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定圖，其中泳道M為蛋白Marker; 泳道I、2均為單克隆抗體3H11，包括上端的重鏈和下端的輕鏈。
[0021]圖2為酶免疫層析檢測試紙條的側面示意圖，圖中：1_硝酸纖維素膜，2-酶標墊，3-底物墊，4-吸水墊，5-展開液墊，6-檢測線，7-質控線，8-底物緩沖液槽，9-底物緩沖液，10-支撐物，11-檢測樣品。
【具體實施方式】
[0022]以下，對本發明的實施方式進行說明。
[0023] 術語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體，即組成該群體的抗體個 體都相同，除了可能存在少量可能的自發突變。因此，修飾語"單克隆"是指該抗體的性質不 是離散抗體的混合物。優選地，所述單克隆抗體包括單價的或是單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合 抗體、豬源化抗體以及上述抗體的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗體片段和含有抗 原結合結構域的任何多肽。抗體為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性結合因 子，因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、豬源化抗體以及抗體的功能等同 物和同源物，也包括含有抗原結合結構域的任何多肽，無論是天然的還是合成產生的。抗體 的實例是免疫球蛋白亞型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亞型亞類;也可以是包含抗原結 合結構域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1 ;和雙鏈抗體((1丨3130(1丨68)。融合至另一多肽的、包 含抗原結合結構域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗體的克隆與表達在 EP. A. 0120694和EP. A. 0125023中描述。抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術來產 生保留原來抗體特異性的其它抗體或嵌合分子。這種技術可以包括將編碼抗體的免疫球蛋 白可變區或互補性決定區（CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區或恒定區加框架區， 參見EP.A. 184187，GB2188638A或EP.A. 239400。還可以對雜交瘤細胞或產生抗體的其它細 胞進行遺傳突變或其它改變，這可以改變或者不改變所產生抗體的結合特異性。用于本發 明的"單克隆抗體"也可用雜交瘤方法制得，因為編碼本發明鼠源化抗體的DNA序列可用本 領域技術人員熟知的常規手段，如根據本發明公開的氨基酸序列人工合成或用PCR法擴增 得到，因而也可用重組DNA方法，可用本領域熟知的各種方法將該序列連入合適的表達載體 中。最后，在適合本發明抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞，然后本領域技術人 員應用熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的單克隆抗體。抗體包含通過二硫橋連接 在一起的多肽鏈幾何體，稱為輕鏈和重鏈的兩