使用細菌毒素衍生的轉運序列遞送生物活性劑的系統和方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請日為2011年9月15日，申請號為201180053563.1，發明名稱為"使用 細菌毒素衍生的轉運序列遞送生物活性劑的系統和方法"的申請的分案申請。
[0002] 相關專利申請
[0003] 本申請要求2010年9月15日提交的美國臨時申請號61/403,394的權益，通過引用 以其全文結合在此。
技術領域
[0004] 本發明的領域部分涉及用于新穎的藥物應用的策略。更確切地說，本發明涉及霍 亂弧菌(Vibrio cholera)ChoIix基因的一種無毒突變體形式(ntCholix)、一種在氨基酸 A386處截短的Cholix變體(Cholix386)、以及其他不同的Cholix衍生的多肽序列用來增強生 物活性治療劑的腸遞送的用途。重要的是，在此所述的這些系統和方法提供了以下項:在沒 有注射的情況下遞送大分子劑量的能力;將負荷例如(但不限于）siRNA或反義分子遞送至 其中需要它們的活性的細胞內區室中的能力；以及基于納米顆粒和樹枝狀化合物的載體穿 過生物膜的遞送，要不然該遞送會由于大多數這種膜的屏障特性而將會受到阻礙。
【背景技術】
[0005] 大多數當前批準的小分子藥物是穿過小腸粘膜而被吸收的，以便提供到體循環的 遞送。事實上，小分子藥物是基于它們穿過腸粘膜的穩定性和有效吸收而被選擇。生物活性 多肽(指的是由氨基酸殘基組成的聚合物，典型地定義為一種蛋白質或肽)的相似的口服遞 送已經成為制藥工業中的一個長期目標。因為胃腸(GI)道的目的是為了消化膳食蛋白質類 和肽類，存在著很多物理學、生理學、以及生物學屏障，這些屏障限制了以一種類似于用小 分子可完成的方式從腸攝取治療性蛋白質和肽的可行性；馬哈圖(Mahato，R.I.)等人，《治 療性藥物載體系統評論》（Crit Rev Ther Drug Carrier Syst，20(2_3):p. 153-214 (2003))〇
[0006] 已經鑒定了能夠用來保護治療性蛋白質和多肽通過胃的許多技術，允許它們到達 小腸中的上皮細胞的吸收表面并且將它們與發揮破壞膳食蛋白質類和肽類的作用的胃腸 環境分開。遺憾的是，然而由于在內腔表面的多肽的內涵體攝取之后通向破壞性溶酶體區 室的細胞內運輸，穿過這種簡單的、單層細胞的有效轉運仍然是一個實質性屏障；伍德利 (Woodley,J.F·)，《治療性藥物載體系統評論》(Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 11(2- 3) :p.61-95(1994))。的確，這種屏障的目的是為了抑制蛋白質類和肽類的攝取，直到這些 大分子可以充分地被降解以便通過氨基酸以及二肽或三肽轉運蛋白而吸收。在此方面，已 經檢驗了克服腸粘膜的物理學、生理學、以及生物學屏障的多種努力。
[0007] 有兩種穿過構成腸粘膜細胞屏障的單層上皮的基本途徑。確切地說，一旦穿過覆 蓋的粘液層，分子可以經由在內部運輸細胞質內容物的、但不混合的一系列囊泡而在鄰近 的上皮細胞之間移動(細胞旁路途徑)或穿過細胞移動(跨細胞途徑）；T. Jung等人，《歐洲制 藥學與生物制藥學雜志》(Eur J Pharm Biopharm,50:147-160(2000))。換言之，在兩種途 徑中，轉運蛋白質或肽治療劑不進入細胞而是停留在細胞的細胞質之外的環境中。
[0008] 治療性蛋白質和肽通過細胞旁路途經的隨機移動的主要屏障是在這些細胞的頂 頸部(apical neck)處的、稱為緊密連接(TJ)的蛋白質復合物。雖然TJ結構的瞬時打開和關 閉可以促進轉運肽穿過腸上皮，這種途徑具有以下關鍵局限性:例如，它對于在約5kDa以上 的分子并非有效;它具有使物質從腸內腔非選擇性地進入體內的潛力;并且它代表涉及腸 上皮表面區域的的僅僅一小部分的途徑。
[0009] 蛋白質或肽治療劑經由跨細胞途徑穿過細胞而隨機迀移的主要屏障是缺乏囊泡 運輸，這種運輸將這些囊泡的內容物遞送至破壞性的（溶酶體的）路徑中。當與細胞旁途徑 相比較時，通過囊泡跨細胞途徑的移動可以接納直徑大至IOOnm的物質，基本上涉及整個上 皮細胞表面，并且在通過使用用于囊泡進入的受體-配體互相作用的物質攝取中可以是高 度選擇性的。因此，對于蛋白質或肽治療劑的上皮轉運而言，如果可以避免破壞性的路徑， 則跨細胞途徑是非常吸引人的。
[0010] 一些病原體已經解決了運輸屏障問題，如通過分泌的多肽毒力因子(這些毒力因 子起到促進和/或穩定宿主感染的作用）的有效轉胞吞作用所證明的。外毒素表示一類由許 多種微生物釋放的蛋白質，它作為有力的毒力因子起作用。外毒素在多細胞生物上發揮作 用，具有充當在人類中的有力毒素的能力；羅斯扎克（Roszak，D.B.)，以及科爾威爾 (Colwell，R.R·)，《微生物綜述》(Microbiol Rev 51: 365-379(1987))。這些蛋白質通常通 過涉及選擇性破壞蛋白質合成的機制而殺死或滅活宿主細胞。因此，僅需要少數分子來殺 死細胞，與細菌外毒素是已知的最毒的毒劑中的一些的觀察相一致。包括由來自白喉棒狀 桿菌(Corynebacterium diphtheria)的白喉毒素(DT)、來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)、以及來自霍亂弧菌（Vibrio cholera)的最近鑒定的稱為 Cho I ix的蛋白質組成的蛋白質家族的這些蛋白質的亞組經由延伸因子2 (EF2)的ADP-核糖 基化而起到使宿主細胞中毒的作用；耶茨(Yates，S.P.)等人，《生物化學科學動態》(Trends Biochem Sci，31:123-133(2006))。這些外毒素被合成為折疊成相異的結構域的氨基酸單 鏈，這些結構域已經被鑒定為具有在靶向、進入宿主細胞、以及使宿主細胞中毒方面的特殊 功能。
[0011 ] 最近已經描述了來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素 A(PE)的 生物學;Mrsny,R.J.，等人，《當代藥物發現》（Drug Discov Today，7(4) :ρ·247-58(2002))。 PE是由613個氨基酸單鏈組成的，具有66828. IlDa的理論分子量(MW)、5.28的等電點（PI)， 并且它功能性地折疊成三個離散結構域，表示為結構域KAla1-Glu 252 K結構域IKGly253-Asn364)、結構域III (Gly4t35-Lys613，它包含ADP核糖基轉移酶活性位點），以及連接結構域II 和結構域III的一個短的二硫鍵連接的環(該環稱為Ib環）(Ala365-Gly4t34)。已經根據分辨率 約O A的晶體衍射確定了這些結構域在pH 8.0時的結構；衛德肯(Wedekind, J.E.)，等 人，《分子生物學雜志》(J Mol Biol ,314:823-837(2001))。結構域I(Ia+Ib)具有一個從13-股卷（13-stranded β-ro11)形成的核心，結構域II是由六個α-螺旋組成的，并且結構域 ΙΠ 具有復合的α/β-折疊結構。研究已經支持PE的模塊性質允許不同的結構域功能的觀點， 這些不同的結構域功能如下：結構域I結合至宿主細胞受體，結構域II涉及膜轉位，并且結 構域III作為ADP核糖基轉移酶起作用。顯示PE可能是響應于環境線索和/或細胞信號由銅 綠假單胞菌在緊密靠近上皮細胞頂面處分泌的；Deng，Q.和巴比耶利(J.T.Barbieri)，《微 生物學年度評論》(Annu Rev Microbiol ,62 :ρ· 271-88(2008))。一旦分泌，在PE的結構域I 結合至膜蛋白α2-巨球蛋白（一種也稱為低密度脂蛋白受體相關蛋白I(LRPl)或CD91的蛋白 質)之后發生進入細胞的內化;參見，例如菲茨杰拉德(FitzGerald，D. J.)，等人，《細胞生物 學雜志》(J Cell Biol, 129(6) :ρ· 1533-41(1995));考那斯(Kounnas，Μ·Ζ·)，等人，《生物化 學雜志》(J Biol Chem，267(18):p. 12420-3(1992))。在內化之后，PE避免運輸至溶酶體而 是被有效地遞送至細胞的基底面，在該基底面處PE以生物活性形式釋放;Mrsny，R. J .，等 人，《當代藥物發現》（Drug Discov Today ,7(4) :ρ· 247-58(2002))。一旦穿過上皮，PE通過 進入粘膜下層空間之內的CD91陽性細胞（巨噬細胞和樹突細胞）中而起到毒力因子的作用， 在該粘膜下層空間內，PE進而與引起結構域III的細胞質遞送的展開路徑相交;參見，例如 馬圖（Mattoo，S·)、李(Υ.Μ. Lee)以及狄克遜(J.E .Dixon)，《當代免疫學觀點》（Curr Opin Immunol，19(4) :p · 392-401 (2007));斯普納（Spooner ,R.A.)，等人，《病毒學雜志》(Virol J,3:p.26(2006))〇
[0012] 霍亂弧菌細菌因與它齊名的毒性劑霍亂毒素 (CT)而最為熟知，霍亂毒素可以導致 急性的危及生命的大量水樣腹瀉。CT是一種蛋白質復合物，該復合物是由用B亞基五聚體組 織的單個A亞基組成，該B亞基五聚體結合至上皮頂面處的細胞表面Gm 1神經節苷脂結構上。 CT是在用攜帶溶源性噬菌體變體(稱為CTXf或CTXcp)的霍亂弧菌毒株進行水平基因轉移 之后由霍亂弧菌分泌的。然而最近的霍亂爆發已經表明某些血清型( n〇n-01，n〇n-0139)的 菌株不表達CT而是使用其他的毒力因子。non-01、non-0139的環境與臨床數據的詳細分析 表明一種與PE具有某種相似性的、新穎的假定的分泌外毒素的存在。
[0013] 約根森（Jorgensen,R.)等人，《生物化學雜志》（J Biol Chem，283(16): 10671-10678(2008))報道了霍亂弧菌的一些菌株事實上的確含有一種與PE具有相似性的、并且他 們將其稱作Cholix毒素(Cholix)的蛋白質毒素。與PE相比，Cholix具有稍微較大的理論分 子量(70703.89Da)以及稍微更酸性的理論等電點（PI) (5.12)。634個氨基酸Cholix蛋白質 的晶體結構已經被解析至約2 A。發現該結構域結構以及組織有點類似于PE:結構域I (Val1-Lys265 )、結構域II (Glu266-Ala386)、結構域III (Arg426-Lys634)、以及Ib環（Ala387-Asn 425)。與PE相比的另外的結構相似性包括:用于細胞活化的弗林蛋白酶位點;可以將毒素 傳遞到宿主細胞內質網的C末端KDEL序列；以及在結構域III之內的ADP核糖基轉移酶活性 位點。
[0014] 引人注目的是，通過氨基酸比對，PE和Cholix沒有共享顯著的遺傳的和有限的相 似性。對于PE樣核苷酸序列，搜索霍亂弧菌的基因組，沒有導致任何種類的匹配。僅在蛋白 質序列水平存在PE樣蛋白質可以由這種細菌產生的提示。即使這樣，在PE與Cholix的氨基 酸序列之間僅有32%同源性，其中相似性(42%同源性)集中在結構域III的ADP核糖基化元 件中，并且對于兩種蛋白質而言結構域I和II的大多數區段具有低水平的氨基酸同源性(約 15%-25%)。而且，相對于PE，Cholix的這種總體安排甚至更引人注目，因為具有相似元件 的這兩種蛋白質是從兩個不同的方向衍生的：銅綠假單胞菌是富含GC的細菌，而霍亂弧菌 富含AT。從兩個不同遺傳方向進化取得幾乎相同的結構但僅有32%氨基酸同源性的這兩種 毒素表明Cholix和PE的結構和功能的相似性可能是基于相似的生存壓力而不是由于相似 的遺傳背景。對于這兩種蛋白質而言，結構域I和II的非常低的氨基酸同源性著重于這兩種 蛋白質的折疊結構的功能重要性而不是它們的氨基酸序列。
[0015] Cholix和PE的C末端部分顯得以可比較的方式通過EF2的ADP核糖基化而在細胞中 毒中起作用。其中通過接合至針對轉鐵蛋白受體的抗體而靶向于癌細胞的Cholix的后面一 半(結構域I缺失）的最近研究表明：涉及EF2的ADP核糖基化的PE和Cholix的C末端部分確實 在功能上是相似的