鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白及制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白及制 備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一種革蘭氏陰性菌，歸于黃 桿菌科(Flavobacteriaceae)，是鴨疫里默氏桿菌病的病原體，能夠引起鴨、鵝、火雞和多種 禽類的一種慢性或急性敗血癥狀的接觸性傳染疾病，呈世界性分布，發病率和死亡率高，已 成為目前嚴重危害養鴨業的主要傳染病之一。該病主要的臨床癥狀主要表現為精神沉郁， 癱地、縮頸、拉黃綠色稀便等癥狀。病變特征是引起宿主的纖維素性氣囊炎、腦膜炎、心包 炎、肝周炎、以及干酪性輸卵管炎，并伴有不同程度的敗血癥，對養殖業的發展存在著巨大 的威脅。
[0003]目前已建立的用于檢測鴨疫里默氏桿菌血清抗體的方法有瓊脂擴散實驗、凝集試 驗、ELISA等，這些檢測方法或是靈敏度、特異性不高，或是由于使用抗原成分的不同而存在 一些不足;而鴨疫里默氏桿菌的防治主要是抗生素進行治療或用菌體疫苗來對相應血清型 感染進行預防。OmpH屬于孔蛋白，目前未見鴨疫里默氏桿菌OmpH研究和應用的相關研究報 道。
【發明內容】
[0004] 為克服現有技術存在的缺點與不足，本發明的目的之一在于提供一種鴨疫里默氏 桿菌OmpH截段重組蛋白，該蛋白能作為鴨疫里默氏桿菌抗體的捕獲劑等。
[0005] 本發明的目的之二在于提供上述鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的制備方法， 該方法可用于OmpH截段重組蛋白的大規模生產。
[0006] 本發明的目的之三在于提供上述制備獲得的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白 的應用。
[0007] 本發明的目的通過下述技術方案實現:一種鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白， 其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008] 上述的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 上述的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的制備方法，具體包括以下步驟：
[0010] A、以RA-CH-I基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO. 4所示的上、下游引物PCR擴增得到鴨疫里默氏桿菌OmpH截段基因片段（OmpHM)，與 pMD 19-T (s imp I e)的連接，得pMD 19-〇mpHM;
[0011] B、用限制性內切酶BamH I和Xho I分別雙酶切pMD19-〇mpHM質粒和原核表達載體 pET32a( + )，進行連接，得重組原核表達質粒pET32a-〇mpHM;
[0012] C、將步驟B提取的重組質粒pET32a-〇mpHM轉化到表達宿主菌誘導表達，得鴨疫里 默氏桿菌截段重組蛋白粗品。
[0013] 進一步，將步驟C所得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白粗品經鎳瓊脂糖凝膠親 和層析純化后，得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白；
[0014] 進一步，步驟C中的宿主菌為菌株BL21(DE3)，在IPTG濃度=1.2mmol/L，誘導溫度 為25°C條件下進行誘導表達9小時，得鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白。
[0015] 本發明的有益效果在于:鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白是選取鴨疫里默氏桿 菌OmpH基因編碼蛋白的主要抗原域(81aa-151aa)，并命名為OmpHM;然后利用基因工程技 術，在其進行克隆的基礎上，將其與原核表達載體pET-32a( + )連接，成功轉化大腸桿菌BL21 (DE3)表達系統進行誘導、表達的基因工程產品。該蛋白的表達形式是OmpHM/His可溶性融 合蛋白，表達的融合蛋白分子量為28kDa，將產品設計為融合表達主要是考慮便于純化；同 時表達蛋白為可溶性表達形式，在蛋白的制備、純化過程中避免了蛋白的變性、復性等過 程，利于保持蛋白的天然活性。經原核表達系統表達后的產品經Western blot進行鑒定后 表明具有與天然蛋白相似的免疫反應活性。
[0016] 上述制備獲得的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的應用主要體現在：
[0017] ①本產品可作為檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的間接ELISA方法的檢測抗原。
[0018] ②可作為預防鴨疫里默氏桿菌的基因工程亞單位疫苗。
[0019] 本發明的產品優點體現在：
[0020] ①由于該檢測抗原是鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白，并非全菌，以此應用該 檢測抗原進行檢測時無散菌危險。
[0021] ②以該蛋白作為抗原解決了鴨疫里默氏桿菌難培養，易污染的問題。
[0022] ③作為ELISA抗原檢測鴨疫里默氏桿菌抗體，特異性強，無交叉反應。
[0023] ④性能穩定、生產成本低，適合工廠化生產，市場應用前景廣。
[0024] ⑤作為亞單位疫苗，具有良好的保護性。
[0025] 更多有益效果，將在實施例中體現。
【附圖說明】
[0026] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0027] 圖1為OmpH截段基因的PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中1為OmpH截段基因 PCR擴 增產物經瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性DNA條帶;M為DNA Marker。
[0028] 圖2為重組質粒pMD19-〇mpHM的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M為DNA Marker; 1為重組 質粒pMD19-〇mpHM用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異 性條帶。
[0029] 圖3為pET32a-〇mpHM的酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M為DNA Marker; 1為 重組表達質粒pET32a-〇mpHM用Xho I單酶切，酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳所獲得的一條特 異性條帶；2為重組表達質粒pET32a-〇mpHM用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產物經瓊脂糖凝 膠電泳所獲得的兩條特異性條帶;3為重組表達質粒pET32a-〇mpHM用BamH I單酶切。
[0030] 圖4為在37°C下，IPTG = O.4mmol/L時誘導表達過夜的OmpH截段重組蛋白的SDS- PAGE電泳圖。其中M為蛋白質Marker; 1為空載體pET-32a( + )表達菌用IPTG誘導后經SDS-PAGE電泳所得結果;2為重組表達質粒pET32a-〇mpHM表達菌用IPTG誘導，得到的菌液進行超 聲波破碎、離心后，所得上清進行SDS-PAGE電泳的結果；3為重組表達質粒pET32a-〇mpHM表 達菌用IPTG誘導，得到的菌液進行超聲波破碎、離心后，所得沉淀進行SDS-PAGE電泳的結 果。
[0031 ] 圖5為37°C時不同IPTG濃度下含有重組質粒pET32a-〇mpHM的宿主菌E.coli BL21 (DE3)誘導表達4小時后，鴨疫里默氏桿菌OmpHM截段重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖。其中，M為 蛋白質Marker; 1為IPTG的終濃度為Ommol/L; 2為IPTG的終濃度為0 · 4mmol/L; 3為IPTG的終 濃度為〇 · 8mmol/L; 4為IPTG的終濃度為1 · 2mmol/L。
[0032] 圖6為不同溫度下IPTG = 0.4mmol/L時含有重組質粒pET32a-〇mpHM的宿主菌 E.coli BL21(DE3)表達鴨疫里默氏桿菌OmpHM截段重組蛋白誘導表達4小時的SDS-PAGE電 泳圖。其中，M為蛋白質Marker; 1為誘導溫度為25°C; 2為誘導溫度為30°C; 3為誘導溫度為37 0C。
[0033] 圖7為37°C和IPTG濃度為0.4mmol/L時不同誘導時間下含有重組質粒pET32a-OmpHM的宿主菌E.coli BL21(DE3)表達鴨疫里默氏桿菌OmpHM截段重組蛋白的SDS-PAGE電 泳圖。其中M為蛋白質Marker; 1為誘導Oh; 2為誘導5h; 3為誘導7h; 4為誘導9h。
[0034] 圖8為鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化后的鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組 蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中M為蛋白質Marker; 1為經鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后的OmpH 截段重組蛋白。
[0035]圖9為鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白Western-blot圖。其中M為預染蛋白質 Marker; 1為OmpH截段重組蛋白的免疫印跡條帶。
[0036] 圖10為鴨疫里默氏桿菌玻片凝集試驗結果圖。在1:2、1:4、1:8和陽性對照孔里分 別有細沙狀凝集顆粒，1:16孔內沒有凝集顆粒。
[0037] 圖11為鴨疫里默氏桿菌微量凝集實驗圖片。在1:8、1:16、1:32和陽性對照孔里均 可見凝集顆粒;1:64孔內無凝集顆粒，僅有部分菌體沉淀在底部，與陰性對照孔相同。
[0038] 圖12為陰性對照組雛鴨人工感染鴨疫里默氏桿菌死亡后的病變組織器官。在心 臟、肝臟、腹腔表面均可以看到一層纖維素性滲出物，形成一層莢膜。
[0039]圖13為免疫鴨疫里默氏桿菌OmpH截段重組蛋白的雛鴨人工感染鴨疫里默氏桿菌 后存活下來的剖解情況。可見腹腔、肝臟和心臟表面均正常，未見纖維素性滲出以及壞死 灶，各器官正常。
[0040] 圖14為RA攻毒鴨子重新分離RA的16sRNA的PCR鑒定。M為DNA Marker; 1、2、3、4分別 為分離菌株的菌落PCR; 5為陰性對照。
【具體實施方式】
[0041] 以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等 著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。 [0042]部分氨基酸相應的縮寫如下：
[0043]谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G;絲氨酸ser S;丙氨酸ala A;蘇氨酸thr T;繳氨酸val V;異亮氨酸ile I;亮氨酸leu L;酪氨酸tyr Y;苯丙氨酸phe F;組氨酸his Η;脯氨酸pro P;天冬酰胺asn N;甲硫氨酸met Μ;谷