三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及小分子熒光探針技術領域，特別涉及三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制 備方法。
【背景技術】
[0002] 三磷酸腺苷（簡稱ATP)是一類高能磷酸化合物。在細胞中它與二磷酸腺苷（簡稱 ADP)的相互轉化實現儲能和放能，從而保證細胞各項生命活動的能量供應;對ATP的檢測有 利于我們了解生命體新陳代謝過程，為與ATP相關的疾病診斷提供幫助。開發新型的ATP分 子熒光探針具有非常重要的現實意義和應用前景。
[0003] 熒光探針具有高度靈敏性，優良的選擇性，反應時間短以及易于操作等優點；在 ATP的檢測中，熒光探針是一種有效的檢測方法。方酸菁染料(SQ)作為一種近紅外吸收的染 料，具有優越的光學性能，即它能降低生物體內物質的自吸收和自發熒光的干擾，提高檢測 的靈敏度和選擇性，降低對生命體的損傷，肉眼即可觀察顏色的變化，所以近紅外染料在生 活中發揮著重要的作用。
[0004] 三磷酸腺苷廣泛存在于動植物的細胞中，其直接為生命活動提供能量。目前檢測 ATP的探針多為有機熒光染料，如:喹琳類、熒光素、羅丹明、芳烴類及其衍生物等，但是這些 熒光染料存在著一些不足，如：對樣品激發光的散射光敏感，這會使探針的檢測靈敏度下 降。此外，在一定范圍內，熒光分子在被測分子上標記的數目越多，其熒光強度會下降，這對 ATP檢測是不利的。盡管有很多探針可被用于ATP的檢測，但是一部分探針的靈敏度不高，或 者不能夠區分與ATP性質相似的分子。而近紅外熒光染料是采用近紅外光譜分析的，其本身 具有很強的穿透能力，在檢測樣品時，不需要對樣品進行繁瑣的處理，使用方便快捷，并可 以降低生物體內物質的自吸收和自發熒光的干擾，所以近紅外熒光探針具有很好的應用前 景。
【發明內容】
[0005] 為了克服上述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供三磷酸腺苷近紅外熒光探 針的制備方法，能夠對ATP快速、靈敏地分析，并克服現有熒光探針的缺點，高效檢測ATP，具 有合成步驟簡單，熒光法分析快捷方便，干擾較小的特點。
[0006] 為了達到上述目的，本發明采取的技術方案為：
[0007] 三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法，其步驟為：
[0008] S1、將方酸菁染料溶于有機溶液中，獲得方酸菁有機溶液；
[0009] S2、將N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有機溶液中，獲得N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺有機溶液；
[0010] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺有機溶液中，在室溫 環境下攪拌2小時，然后去除有機溶液，經柱色譜分離提純，獲得三磷酸腺苷近紅外熒光探 針。
[0011] 所述有機溶液包括二氯甲烷溶液，特別包括無水二氯甲烷。
[0012] 所述方酸菁有機溶液的濃度為4.19mM〇
[0013] 所述N，N-二（2-氨乙基）-l，2-乙二胺有機溶液的濃度為24.07mM。
[0014] 所述方酸菁染料與N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺的摩爾比為1:6。
[0015] 所述室溫環境為18-25°C。
[0016]所述三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結構式為：
[0018]本發明的工作原理為：
[0019]將方酸菁染料與N，N_二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺在有機溶劑一一二氯甲烷溶液中 進行反應，反應生成三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0020] 本發明的有益效果為：
[0021] 本發明可以克服現有熒光探針性能上的不足，能夠高效、靈敏的在緩沖體系中檢 測ATP;探針在與ATP作用后，會不斷使探針的熒光增強，并可極大地減少外界的干擾，達到 理想的效果，這是該近紅外熒光探針優勢所在。本發明具有合成步驟簡單，熒光法分析快捷 方便，干擾較小等優點。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP后的紫外吸收譜 圖。
[0023]圖2是本發明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP后的熒光譜圖。
[0024] 圖3是本發明制備的近紅外熒光探針的熒光強度與ATP之間的線性關系圖。
[0025] 圖4是本發明制備的近紅外熒光探針的檢測專一性的實驗圖。
[0026] 圖5是本發明制備的近紅外熒光探針對不同的核苷磷酸的響應圖。圖中，為ATP， ?為ADP，▲為AMP，▼為CTP，婣為GTP，?為TTP，?為UTP。
[0027] 圖6是本發明制備的近紅外熒光探針與不同的核苷磷酸作用后所呈現的顏色變化 圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0029]參見附圖，本發明為三磷酸腺苷近紅外熒光探針的制備方法，其步驟為：
[0030] S1、將方酸菁染料溶于有機溶液中，獲得方酸菁有機溶液；
[0031 ] S2、將N，N-二（2-氨乙基)-1，2-乙二胺溶于有機溶液中，獲得N，N-二（2-氨乙基)- 1，2-乙二胺有機溶液；
[0032] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N-二(2-氨乙基)-l，2-乙二胺有機溶液中，在室溫 環境下攪拌2小時，然后去除有機溶液，經柱色譜分離提純，獲得三磷酸腺苷近紅外熒光探 針。
[0033]所述有機溶液包括二氯甲烷溶液，特別包括無水二氯甲烷。
[0034]所述方酸菁有機溶液的濃度為4.19mM。
[0035] 所述N，N-二(2-氨乙基)-1，2-乙二胺有機溶液的濃度為24 · 07mM。
[0036]所述方酸菁染料與N，N-二(2-氨乙基)-1，2_乙二胺的摩爾比為1:6。
[0037] 所述室溫環境為18_25。(3。
[0038]所述三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結構式為：
[0042]公式 1
[0043]實施例一:三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0044]本實施例包括以下步驟：
[0045] S1、將250mg的方酸菁染料溶于IOOmL的無水二氯甲烷中，獲得方酸菁有機溶液；
[0046] S2、將360yL的N，N-二（2-氨乙基)-1，2_乙二胺溶于無水二氯甲烷中，獲得N，N-二 (2-氨乙基)_1，2-乙二胺有機溶液；
[0047] S3、將方酸菁有機溶液滴加到N，N_二(2-氨乙基)_1，2_乙二胺有機溶液中，在室溫 環境下劇烈攪拌2小時，然后去除無水二氯甲烷，獲得近紅外染料粗品，然后經柱色譜分離 提純，獲得藍紫色固體粉末狀的三磷酸腺苷近紅外熒光探針。
[0048]獲得的三磷酸腺苷近紅外熒光探針的分子結構如下所示：
[0050] ATP分子熒光探針結構表征數據如下：
[0051] 1H NMR(DMS0-d6,500MHz)，S(ppm)8.68(s，2H)，7.78(s，2H)，7.72(d，2H，J = 7.5)， 7.46(d,2H ,J = 8.0) ,7.42(dd,4H ,Ji = 7.5 ,J2 = 14.0) ,7.26(t, 2H ,J = 7.5), 7.208(t, 2H J = 9.0),6.88(t,2H,7.5),6.10(s,2H),5.80(s,2H) ,4.26(dd ,4H ,Ji = 7.0 J2 = 14.0), 3.75 (s,4H) ,3.00(t,2H,J = 6.0) ,2.92(t,4H,J = 5.0) ,2.85(t,2H,J = 6.5) ,1.23-1.17(m, 18H).13C NMR(DMS0-d6,125MHz) ,5(ppm)173.36,163.09,160.94,159.62,157.58,156.02, 140.07,128.20,127.91,122.24,I19.66,I13.06,112.56,86.42,85.99,12.83.MS(ESI+) found 1125.66.[M-CF3SO3J+,calcd for 1125.29.
[0052] ATP分子熒光探針性能實驗
[0053] 將已合成好的ATP分子熒光探針配成含有1%的二甲基亞砜(DMSO)緩沖溶液，然后 將緩沖溶液稀釋到檢測所需要的濃度，對探針的性能進行檢測。
[0054] (I)ATP分子熒光探針的緩沖溶液中不斷加入ATP，對該探針的紫外吸收進行分析。
[0055] 參見圖1，圖1所示的為本發明制備的近紅外熒光探針的緩沖溶液中逐漸加入ATP 后的紫外吸收譜圖；圖中，橫坐標為波長（wavelength)，單位為nm;縱坐標為吸光度 (absorption)〇
[0056] 將ATP不斷地加入到溶有近紅外熒光探針的緩沖液中，探針的濃度為5微摩爾每 升，如圖所示，隨著ATP的不斷加入，590nm處的聚集體的吸收峰開始逐漸減弱，在710nm處的 聚集體的吸收分開始逐漸的增強，實驗結果表明，當ATP分子與近紅外熒光