新城疫病毒強、弱毒一步法實時熒光rt-pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 發明涉及一種檢測新城疫病毒強、弱毒的一步雙重熒光RT-PCR試劑盒的研制，屬 于一種快速、靈敏的針對農產品的安全檢測技術，為禽類養殖和禽產品的"綠色產業"提供 技術保障;主要應用于農牧企業和監管機構，具體涉及新城疫病毒強、弱毒一步法實時熒光 RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 新城疫（Newcastle disease,ND)是一種由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV)引起的禽類烈性、高度接觸性、致死性傳染病，以侵害雞和火雞為主，同時也感 染其他家禽和野禽，ND具有傳播迅速、發病率高、病死率高的特征，同時也是困擾我國養禽 業的重要疫病之一。近年來，隨著ND弱毒疫苗的廣泛應用，新城疫的發病情況和流行態勢日 趨復雜，普通的血清學診斷方法(HI試驗)不能區分弱毒疫苗誘導的抗體與現場速發型強毒 感染的反應，而毒力測定通常包括雞胚平均死亡時間(MDT)、1日齡雛雞腦內接種致病指數 (ICPI)和6周齡雞靜脈接種致病指數(IVPI)等致病性試驗，這些試驗不僅需要實驗動物，而 且耗時費力，不能滿足生產、防疫的需要，在實際應用中有一定的局限性。
[0003] 在實際應用中，當樣品量非常大時，單重熒光PCR在成本和時間方面就存在一定的 劣勢，迫切需要一種高通量、低成本、高效率的方法來進行批量快速檢測。多重熒光PCR采用 多對引物擴增檢測多個模板，克服了單重熒光PCR的不足。建立多重熒光PCR方法比單重的 要復雜得多，其對試劑和引物的要求更高，同時需要保證不同探針所標記的熒光基團間無 相互干擾，使用的熒光定量PCR儀器具有相應的多個檢測通道。目前市場上還未出現檢測新 城疫病毒強、弱毒一步雙重熒光RT-PCR的試劑盒。
【發明內容】
[0004] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏性好、特異性高、準確可靠、 快速方便的新城疫病毒強、弱毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，同時檢出新城疫病毒 強、弱毒株，為新城疫的監測提供技術支撐。
[0005] 為解決上述問題，本發明采取以下技術方案:新城疫病毒強、弱毒一步法實時熒光 RT-PCR檢測試劑盒包括引物組和探針組，引物組有引物F和R，它們分別具有序列表 SEQ. ID. NO. 1和2的堿基序列。探針組有探針V-T和L-T，它們分別具有序列表SEQ. ID. N0.3和 4的喊基序列。
[0006] 強毒探針V-T的5'端標記有報告熒光染料FAM，3'端標記有淬滅熒光染料BHQ1;弱 毒探針L-T的5'端標記有報告熒光染料J0E，3'端標記有淬滅熒光染料BHQ2。
[0007] 引物?和1?、探針￥-1'、探針1^-1'的摩爾質量比為2:2:3:1
[0008] 該試劑盒含有以下試劑
[0009] A液:PCR擴增緩沖液、通用引物F和R、探針v-τ和L-T;
[001 ο] B液:NA-1+LaSota模板，作為陽性對照；
[0011 ] C液:ddH20作為陰性對照。
[0012] PCR反應體系中通用引物F、R終濃度為0.4μΜ/1，強毒探針終濃度為0.6μΜ/πι1，弱毒 探針終濃為〇.2μΜ/1。
[0013]針對目前缺乏對新城疫病毒強、弱毒株的檢測和診斷的有效可靠的技術，發明人 通過對引物和探針不同濃度的配比，獲取最佳引物和探針濃度的組合。據此建立了新城疫 病毒強、弱毒一步法實時熒光RT-PCR的檢測方法，并制定了檢測試劑盒。實驗證明，本發明 具有以下優點：
[0014] 1)檢測時間短
[0015]應用本發明可實現一管二檢的目的，并且反轉錄和PCR-步完成，僅需約lh，并且 檢測結果可以直接通過電腦觀察，而常規的RT-PCR方法起碼需要2.5h來完成擴增反應，然 后還需要花40min進行瓊脂糖凝膠電泳來觀察結果。
[0016] 2)檢測敏感性高且特異性強
[0017] 當新城疫病毒強、弱毒株同時存在時，本發明對其檢測的Ct值與單個病毒檢測的 Ct值比較，其結果基本一致，并未影響對新城疫病毒強、弱毒的檢出及檢出的敏感性。另外 利用本發明檢測敏感性非常高，對新城疫病毒強、弱毒株分別能檢測到2.3 X104拷貝數和 1.8 X102拷貝數，該方法對新城疫病毒強毒株檢測的敏感性與普通PCR方法檢測敏感性相 當，對新城疫病毒弱毒株檢測的敏感性比普通PCR方法檢測敏感性高100倍，因此該試劑盒 可用于對新城疫病毒強、弱毒株的檢測，本發明對新城疫病毒的防控具有重要意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒強毒的敏感性實驗(FAM通道)結果圖：1-7分別 為2.3X107~2.3X10 1拷貝ΛΛ，8為空白對照。
[0019]圖2是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒弱毒的敏感性實驗(J0E通道)結果圖：1-7分別 為1.8 X 107-1.8 X 101拷貝ΛΛ，8為空白對照。
[0020]圖3是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒強毒的特異性實驗(FAM通道)結果圖：1-5分別 為 NA-1、NA-l+LaSota、IBV、H9N2、IBDV，6 為空白對照。
[0021]圖4是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒弱毒的特異性實驗(J0E通道)結果圖：1-5分別 為 LaSota、NA-l+LaSota、IBV、H9N2、IBDV，6 為空白對照。
[0022]圖5是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒強毒株NA-1的組內重復(FAM通道)結果圖：1-3 分別為同一批次內3個重復樣品，4-6為空白對照。
[0023]圖6是熒光RT-PCR檢測新城疫病毒弱毒株LaSota的組內重復(J0E通道)結果圖：1-3分別為同一批次內3個重復樣品，4-6為空白對照。
【具體實施方式】
[0024]下實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法;所使用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。具體所用材料和試劑如下：
[0025] 美國ABI公司stepone熒光定量PCR儀;RNA提取試劑盒（116671650001)購于羅氏生 物科技有限公司；dNTP、Hs-Taq酶、MLV反轉錄酶等試劑購于大連寶生物公司；膠回收試劑盒 和質粒提取試劑盒購自北京天根公司；pGEM-T Easy試劑盒購自Promega公司；T7體外轉錄 試劑盒購自Fermengtas公司；One Step PrimeScript RT-PCR Kit(Perfect Real Time)購 自大連寶生物公司（大連TaKaRa公司）；0.1ml 8Strip Real-time PCRTubes購自生工生物 工程(上海)股份有限公司。
[0026]實施案例中所用到的毒株具體信息如下：
[0027] 新城疫病毒(NDV NA-1株)其GenBank登錄號為DQ659677.1，強毒株，保存于吉林大 學動物醫學學院動物傳染病實驗室。
[0028] 新城疫病毒(NDV LaSota株)其GenBank登錄號為JF950510.1，弱毒株，保存于吉林 大學動物醫學學院動物傳染病實驗室。
[0029] 雞傳染性喉氣管炎病毒（IBV H52株)其GenBank登錄號為KR605488.1，保存于吉林 大學動物醫學學院動物傳染病實驗室。
[0030] H9N2亞型禽流感病毒其GenBank登錄號為AF400788.1，保存于吉林大學動物醫學 學院動物傳染病實驗室。
[0031] 雞傳染性法氏囊病毒（IBDV)其GenBank登錄號為KC603937.1，保存于吉林大學動 物醫學學院動物傳染病實驗室。
[0032 ]實施例1、引物與TaqMan探針的設計與合成
[0033] 根據GenBank中新城疫病毒F基因保守序列，采用Primer Express 3.0軟件，設計 出多對通用引物根據GenBank中新城疫病毒強、弱毒株F基因裂解位點附近序列，采用 Primer Express 3.0軟件，設計出多套強毒探針和弱毒探針，通過分析其引物間的二聚體 以及發卡結構，選定一對通用引物和兩條強、弱毒探針。（表1)
[0034] 表1引物和TaqMan探針序列（5，-3')
[0035]
[0036]實施例2、一步法實時熒光定量RT-PCR檢測的建立 [0037] 一、一步法實時熒光定量RT-PCR檢測方法的確定 [0038] 1、樣品的制備
[0039] 1)病毒增殖
[0040] 將NDV經雞胚尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚，置于37°C溫箱內孵育，棄去24h內死亡 雞胚，無菌采集24h后病死雞胚尿囊液，置于-80°C冰箱保存。
[0041 ] 2)RNA 的提取
[0042] 取NDV病毒尿囊液200yL，加入600yL Trizol裂解液，緩慢搖勻作用5-10min，再加 入600yL酸:氯仿:異戊醇(25:24:1)混合液，顛倒混勾后，冰浴15111；[11，4°0135001'/111；[11離心15 分鐘，上清轉管，加入等體積異丙醇，顛倒混勾后，室溫放置51]1；[11，4°(3135001'/1]1；[11離心20分 鐘，棄上清，75 %預冷乙醇洗滌，加入DEPC處理水溶解即為RNA模板，并用紫外分光光度計測 定其含量，_80°C保存備用。
[0043] 3)RNA的反轉錄
[0044] 將新城疫病毒反轉錄合成cDNA，具體如下:建立如下反轉錄應體系，總反應體系為 20yL:新城疫病毒RNA5yL; 5 XMLV Buffer(大連寶生物工程有限公司，產品目錄號：2680A)4 yL;dNTP(2.5mmol/L)(大連寶生物工程有限公司，產品目錄號：4019)8yL;RNase(100UAiL) (大連寶生物工程有限公司，產品目錄號:2313A)UiL;MLV反轉錄酶(大連寶生物工程有限公 司，產品目錄號：2680A) lyL，隨機引物lyL。瞬離5-10s，封口膜封口然后置于水浴鍋42°C 50min，70°C 15min，得到新城疫病毒cDNA。
[0045] 2、標準品的制備
[0046]將上述得到的新城疫病毒cDNA為模板進行PCR擴增，反應總體系為15yL:ddH204.5 yL，Mix(購自大連寶生物工程有限公司，產品目錄號:RR003)7.5yL，上下游引物（ΙΟμΜ)各1μ L(見表一），cDNA模板lyL，反應條件94°C預變性5min，94°C30s，54°C30s，72°C35s，30個循 環，72°C 延伸 lOmin。
[0047] PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段后克隆至pGEM-T Easy載體，陽性克 隆菌pGEM-NDV送大連寶生生物技術有限公司進行測序，pGEM-NDV陽性克隆質粒中含有的 PCR產物大小為184bp，具有序列表中第1-184位核苷酸，說明為陽性克隆含有NDV病毒，并計 算出拷貝數為