一種莖環結構組合探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物分析技術領域，具體涉及一種具有莖環結構的組合探針，以及該 組合探針在端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測中的應用。
【背景技術】
[0002] 端粒酶(Telomerase)是一種使端粒延伸的反轉錄DNA合成酶，是由RNA和蛋白質組 成的核糖核酸-蛋白質復合物。端粒酶彌補了因每次細胞分裂而逐漸縮短的端粒長度。但是 端粒酶的活性在正常體細胞中受到相當嚴密的調控，所以端粒酶活性在正常的人體細胞中 受到抑制，但在腫瘤細胞中被激活，與癌細胞的不斷增殖密切相關。所以檢測端粒酶的活 性，可以實現對癌癥的診斷，同時以端粒酶為靶標分子，研究有效的端粒酶活性抑制劑，對 開發抗癌藥物具有重要意義。傳統的檢測端粒酶的方法主要是基于PCR擴增技術的端粒重 復放大的方法（Telomeric Repeat Amplification protocol，TRAP)。該方法在經過 PCR 擴 增后進行電泳分離和檢測，可以檢測到幾個癌細胞中端粒酶的活性，但是操作比較繁瑣，而 且電泳分析不能達到定量分析的結果。更為重要的是在篩選端粒酶活性抑制劑實驗過程 中，這些抑制劑也可能抑制PCR擴增反應中DNA聚合酶的活性，所以TRAP方法不適于端粒酶 抑制劑的篩選檢測。隨后發展起來的端粒酶檢測方法是放射性同位素標記后的成像分析， 該方法存在放射性污染，對人體和環境有一定的危害，由此大大增加了操作的復雜性，限制 了該方法的應用。所以人們一直在努力研究建立端粒酶活性檢測方法。如表面等離子體共 振、電化學分析、量子點熒光共振能量轉移、端粒酶誘導生成金屬納米線、具有催化性能的 分子信標、PPI生物發光等。但是這些方法由于缺乏有效的DNA擴增信號放大過程，導致這些 方法的靈敏度都達不到TRAP的水平。因此，考慮到抗癌藥物篩選工作量大以及檢測成本等 各方面的需要，理想的端粒酶活性檢測方法應擺脫放射性污染的缺點，且需滿足檢測快速、 操作簡便、選擇性好、靈敏度高、可靠、普適、經濟等特點。
[0003] RNA和DNA是生命體重要的遺傳物質，RNA和DNA的表達水平與癌癥發展密切相關， 可以作為癌癥早期診斷的標志物，對特定序列RNA和DNA進行準確、靈敏檢測對于RNA和DNA 生物功能的研究和癌癥早期診斷都具有十分重要的意義。RNA和DNA的分析方法主要為雜交 反應的檢測方法。其中Southern印跡雜交方法需要經過電泳分離，結合放射性同位素標記 或酶標記利用放射自顯影或酶反應顯色實現RNA和DNA的定量分析。該方法存在放射性危 害，對人體造成傷害，且檢測信號無法實時監測等弊端，需要復雜的操作步驟才能實現信號 的讀出。分子信標(Molecular Beacon，簡稱MB)探針技術以發夾結構存在，其莖部雙鏈兩端 分別標記熒光基團和猝滅基團，無目標RNA或DNA存在時，MB以發夾結構存在，熒光猝滅。目 標RNA或DNA存在時會與MB雜交產生目標RNA或DNA的特異性熒光信號，該分子信標檢測方法 已經獲得了廣泛應用。但需要指出的是該方法缺乏信號放大機制，使得檢測靈敏度受到了 很大的限制，并且分子信標需要雙標記，價格昂貴。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是克服現有端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測存 在的問題，提供一種成本低廉、靈敏度高、選擇性好的莖環結構組合探針，以及該組合探針 在端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測中的應用。
[0005] 解決上述技術問題所采用的技術方案是:該組合探針由兩個具有莖環結構的DNA 序列組成，其中探針I和探針II從5'端到3'端依次為莖環區、檢測物識別區，所述的檢測物 為端粒酶、RNA或DNA，探針I和探針II的莖環區的堿基序列相同或不同，其中當檢測物為端 粒酶時，所述探針I的檢測物識別區是端粒酶底物序列，探針II的檢測物識別區是與端粒酶 延伸序列中8~40個堿基互補的序列；當檢測物為RNA或DNA時，所述探針I的檢測物識別區 是與待測RNA或DNA的鄰近3'端8~40個堿基互補的序列，探針II的檢測物識別區是與待測 RNA或DNA的鄰近5'端8~40個堿基相同的序列。
[0006 ]上述的莖環區的莖的長度優選為5~18個配對的堿基序列，莖環區的環的長度優 選為15~35個堿基序列。
[0007] 上述的檢測物為端粒酶時，探針I的檢測物識別區是端粒酶底物序列，優選探針II 的檢測物識別區是與端粒酶延伸序列中15~25個堿基互補的序列。
[0008] 上述的檢測物為RNA或DNA時，優選探針I的檢測物識別區是與待測RNA或DNA的鄰 近3'端15~25個堿基互補的序列，優選探針II的檢測物識別區是與待測RNA或DNA的鄰近5' 端15~25個堿基相同的序列。
[0009] 本發明莖環結構組合探針在檢測端粒酶活性中的應用，具體檢測方法為:將檢測 物識別區為端粒酶底物序列的探針I加入待測端粒酶中進行反轉錄反應，反應完后加入檢 測物識別區是與端粒酶延伸序列中8~40個堿基互補的序列的探針II，在Bst DNA聚合酶的 作用下進行環介導的等溫核酸擴增反應，并加入SYBR Green I熒光染料，實時檢測熒光信 號，根據實時熒光曲線的最大拐點所對應的時間即可確定端粒酶的活性高低，時間越長說 明端粒酶活性越低，時間越短說明端粒酶活性越高。
[0010] 本發明莖環結構組合探針在定量檢測RNA或DNA中的應用，具體檢測方法為:將檢 測物識別區是與待測RNA或DNA的鄰近3'端8~40個堿基互補的序列的探針I加入不同濃度 的待測RNA或DNA標準樣品中，并加入頂替引物A，在BstDNA聚合酶的作用下進行延伸頂替反 應，反應結束后加入檢測物識別區是與RNA或DNA的鄰近5'端8~40個堿基相同的序列的探 針II和頂替引物B，進行延伸頂替反應和環介導的等溫核酸擴增反應，并加入SYBR Green I 熒光染料，實時檢測熒光信號，繪制濃度與實時熒光強度的最大拐點對應時間的標準曲線； 按照上述方法測試待測RNA或DNA樣品的實時熒光強度最大拐點對應的時間，結合標準曲線 即可確定待測樣品中RNA或DNA的含量。
[0011] 上述的頂替引物A是與待測RNA或DNA中5~30個堿基互補的序列，且該5~30個堿 基與待測RNA或DNA中與探針I檢測識別區互補部分的3'端鄰近;所述的頂替引物B是與待測 RNA或DNA中5~30個堿基相同的序列，且該5~30個堿基與待測RNA或DNA中與探針II檢測識 別區相同部分的5'端鄰近。
[0012] 本發明莖環結構組合探針在端粒酶抑制劑篩選中的應用，具體方法與端粒酶活性 檢測方法相同，只需在制備端粒酶延伸產物時加入端粒酶抑制劑。
[0013] 本發明的有益效果如下：
[0014] 1、本發明組合探針不需要熒光標記和放射性元素標記，該探針特有的頸環結構為 下一步核酸擴增反應提供了特異性的擴增模板，克服了傳統放射性標記存在的放射性危害 和大多數核酸擴增反應中非特異性擴增的發生。
[0015] 2、本發明組合探針用于端粒酶活性分析操作極為簡便，只需將癌細胞經過裂解就 可以得到含有端粒酶的細胞裂解液，直接用于端粒酶底物的反轉錄延伸反應，不需要復雜 的分離提純過程，大大提高了該方法操作的簡便性，在普通的生物實驗室即可完成，克服了 現有端粒酶活性檢測方法步驟繁瑣、成本較高、靈敏度低和選擇性低等缺點，可以有效地檢 測到單個癌細胞中端粒酶的活性，應用前景廣闊。
[0016] 3、本發明組合探針可通過實時熒光分析法進行端粒酶活性檢測，而熒光分析方法 非常適用于與一些自動化儀器相結合進行高通量檢測，因此在高通量端粒酶抑制劑的篩選 中也展現出了巨大的應用潛力。
[0017] 4、本發明組合探針對癌細胞中RNA和DNA也可以進行良好的定量檢測，克服了升降 溫過程耗時的缺點，實現了恒溫條件下的信號快速放大，具有高的靈敏度和擴增效率。
[0018] 5、本發明組合探針還可通過終點熒光檢測、共振光散射檢測、凝膠電泳檢測等分 析方法進行端粒酶活性及RNA和DNA的定量檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1是實施例1中莖環結構組合探針檢測端粒酶的原理示意圖。
[0020] 圖2是熒光強度隨著端粒酶濃度變化的實時熒光曲線圖。
[0021 ]圖3是不同濃度抑制劑對端粒酶活性抑制的實時熒光曲線圖。
[0022] 圖4是實施例2中莖環結構組合探針檢測mRNA的原理示意圖。
[0023] 圖5是熒光強度隨著mRNA濃度變化的實時熒光曲線圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的保護范圍不僅限于 這些實施例。
[0025] 實施例1
[0026] 針對端粒酶底物序列5' -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，設計合成具有莖環結構的探針 I 和探針 I I ， 探針 I 的堿基序列為 5 '- CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '(由寶生物工程（大連）有限公司提供）；探針I I的堿基序列為5 '-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTCAGTCACGACGATTTTCCCTAACCCTAACCCTAACCC -3'(由寶生物工程(大連)有限公司提供）。
[0027] 采用上述探針I和探針II檢測宮頸癌細胞(Hela)中的端粒酶活性，具體方法如下： [0028]將培養的他1&細胞從培養基中消化離心分離，用冷的0^^5緩沖溶液（1〇111111〇1/1磷 酸鹽，O.lmol/L NaCl，pH 7.4)洗滌離心3次，然后以2000轉/分離心511^11。洗滌后的細胞加 入冷的D-PBS緩沖溶液中，調節細胞濃度為lOOcell/yL。分別向100個(3組）、10個(5組)和1 個（10組)Hela細胞中加入lyL預冷的CHAPS細胞裂解緩沖溶液，在冰上放置30分鐘，得到不 同濃度的Hela細胞裂解液，其中10個Hela細胞和1個Hela細胞是利用顯微操作系統取出。 [0029]在200yL離心管中分別加入1.8yL水、0.5yL端粒酶反轉錄延伸反應緩沖溶液 (200mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2,630mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，0.5%吐溫-20， pH=8.3，25°C)、1.OyL 2.5mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.5yL 2ymol/L探針I水 溶液、〇.2yL 40u