一種檢測apoe基因多態性的引物及其方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測ΑΡ0Ε基因多態性的引物及其方 法。
【背景技術】
[0002]載脂蛋白E(apolipoprotein Ε,ΑροΕ)是血楽:中重要的載脂蛋白之一，其基因定位 于第19對染色體長臂上，長37kb，其包含4個外顯子和3個內含子。ApoE有三種構體 (isoform)即E2、E3和ELApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸 (Arg)和半胱氨酸(Cys)的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg;E2都 是Cys;112位為Cys和158位是Arg者為Ap 〇E3異構體，在自然人群中，基因頻率E3分布最高， ApoE3/3表型分布約70%。人群中可有六種不同的表型：三種純合子(E2/2，E3/3，E4/4)和三 種雜合子(E2/3，E2/4，E3/4)。
[0003] ApoE主要在肝臟合成、分泌和代謝，參與脂質的運輸、儲存及排泄，有修復組織、抑 制血小板聚集、免疫調節等作用。李冬梅等發表了一篇題目為"ΑΡ0Ε基因多態性與阿爾茨海 默病的相關性研究"的論文，該論文表明ΑΡ0Εε4等位基因，HDL-C與散發性AD有關聯，ΑΡ0Εε4 可能是散發性AD發病的危險因素，并建議把ΑΡ0Εε4和HDL-C等作為散發性AD的生物標記。現 代研究發現，ApoE基因多態性還與冠心病(coronary heart disease，CHD)、高脂血癥、腦梗 塞、Alzheimer病(AD)和慢性乙型肝炎等疾病有著密切的關系。因此，研究和開發出檢測 ApoE基因多態性的方法或試劑盒對臨床具有重大的意義。
[0004] 中國專利申請201110446186. X公開了 ΑΡ0Ε基因檢測試劑盒及擴增方法和檢測方 法，所述試劑盒包括檢測基因 APOE rs429358位點和rs7412位點的引物及內參引物，所述檢 測ΑΡ0Ε基因 rs429358位點的引物包括正向野生型引物和正向突變型引物;所述檢測ΑΡ0Ε 基因 rs7412位點的引物包括正向野生型引物和正向突變型引物;所述APOE基因內參引物 包括正向內參引物和反向共用引物。所述ΑΡ0Ε基因檢測試劑盒是對受檢樣本DNA分別用野 生型和突變擴增緩沖液進行擴增，在每個反擴增反應中同時對2個目的片段和1個內參片段 進行擴增，擴增后經凝膠電泳在紫外光下見到根據片段大小區分開的產物條帶，根據條帶 的有無判斷2個SNP位點的基因型。
[0005] 中國專利申請201510288426.6公開了檢測ApoE基因多態性的引物、試劑盒及其 PCR方法，所述檢測ApoE基因多態性的引物包括檢測rs429358位點和rs7412位點的兩組引 物。該檢測試劑盒能夠大大增加等位基因特異性引物PCR區分不同等位基因位點的能力，使 不同位點間的非特異性交叉擴增的可能性降到最低，能夠做到真正"全或無"式的擴增，不 僅有很好的特異性，也具有非常好的靈敏度，能檢出lng基因組DNA中的基因型分布情況。
[0006] 然而，上述的ApoE基因多態性的檢測引物較復雜，而且檢測步驟較繁瑣，不利于該 檢測方法的推廣和利用。因此，研究和發開出檢測方法簡單，操作便捷，引物特異性高，檢測 結果精確度高的ApoE基因多態性的檢測方法仍是目前研究的重點。
【發明內容】
[0007] 為了解決現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種檢測ΑΡ0Ε基因多態性的引物及 其方法，該引物主要用于檢測ΑΡ0Ε基因中APOE _T112Ch和AP0E_ C158T的兩個位點，具有特 異性好、靈敏度高、準確性好等優點，為ΑΡ0Ε基因多態性提供了一種簡單有效的檢測方法。
[0008] 本發明提供了一種檢測ΑΡ0Ε基因多態性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物為：針對ΑΡ0Ε的上游引物5 ' - GCCTACAAATCGGAACTGGA-3 '（SEQ ID N0.1)和下游引物5'- ACCTGCTCCTTCACCTCGT-3'（SEQ ID N0.2);所述SNaPshot PCR引 物包括：針對AP0E_T112C的SNaPshot PCR引物5 ' -GCGCGGACATGGAGGACGTG-3 '（ SEQ ID N0.3);針對 AP0E_C158T 的 SNaPshot PCR 弓| 物5'_ ttttttttttttttttttgcgatgccgatgacctgcagaag_3' （SEq ID N〇.4)。
[0009] 進一步地，所述SNaPshot PCR引物中AP0E_T112C與AP0E_C158的引物濃度比為1: 1〇
[0010] 另外，本發明還提供了一種檢測ΑΡ0Ε基因多態性的方法，包括如下步驟： S1提取DNA樣品； S2以步驟S1提取的DNA樣本為模板，采用權利要求1中所述的PCR擴增引物進行多重PCR 擴增，并對擴增產物進行純化； S3以步驟S2純化后的PCR擴增產物為模板，采用權利要求1中所述的SNaPshot PCR引物 進行SNaPshot PCR擴增，并對SNaPshot PCR擴增產物進行純化； S4采用毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。
[0011] 進一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。
[0012] 進一步地，所述步驟S2中的多重PCR擴增反應條件包括:階段1:98°C 3min;階段2: 98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C lmin;階段5:返回到階段2,29個循環;階段6:72°C 5min;階段7:25°C保溫。
[0013] 進一步地，所述步驟S3中的SNaPshot PCR擴增反應條件包括:階段1:96°C 10s;階 段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1，25個循環;階段5:4°C保溫。
[0014] 進一步地，所述步驟S4中采用GENEMAPPERID V4.1軟件對檢測結果進行分析。
[0015] 除此之外，本發明提供的檢測ΑΡ0Ε基因多態性的引物在制備檢測ΑΡ0Ε基因多態性 試劑中的用途。
[0016] 與現有技術相比，本發明提供的技術方案具有以下優勢:本發明提供的檢測ΑΡ0Ε 基因多態性的引物具有特異性好，不會發生交叉反應，準確性高的優點，實現了 ΑΡ0Ε基因多 態性的檢測，為冠心病、中風和阿爾茨海默病早期預防等疾病提供了風險或參考依據，同時 還可以輔助ΠΙ型尚脂蛋白血癥的診斷，具有重大的臨床意義。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明提供的ΑΡ0Ε基因引物的擴增片段； 圖2為本發明提供的ΑΡ0Ε基因 SNaPshot PCR引物的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0019]實施例一、引物 本發明提供的ΑΡ0Ε基因引物如表1所示，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物，所述 PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物是相對應的。本發明提供的所有引物序列均通過UCSC數 據庫比對，無已知SNP位點。
[0020]表1本發明提供的引物
實施例二、引物的特異性 將本發明提供的引物于U