一種快速檢測水體中小瓜蟲的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，特別涉及水體中小瓜蟲DNA樣本的采集、提取、擴增 及鑒定方面，具體是指一種水體小瓜蟲快速檢測方法。
【背景技術】
[0002] 小瓜蟲屬于原生動物門、纖毛蟲綱、膜口目、凹口科、小瓜蟲屬，是一種世界性分布 的淡水魚類寄生蟲，在高密度水產養殖中引起魚類暴發性感染，導致大批魚死亡，造成巨大 經濟損失。
[0003] 為了有效控制該病的發生，國內外研究學者探討了該病病原的部分生物學特性、 病理特點、物理化學及中草藥對離體小瓜蟲的殺滅效果、小瓜蟲不同免疫疫苗的制造。除基 礎研究外治療性實驗的結果不是效果不理想就是應用性較差。綜合養殖經驗和實驗結果來 看，目前對于小瓜蟲病的防治策略應以防為主，治為輔。所以，及時了解水體中小瓜蟲的存 在狀態，提前做好水體處理或及時轉走養殖魚體，是防止小瓜蟲病爆發的最佳途徑。
【發明內容】
[0004] 本發明的內容是為了及時發現水體中小瓜蟲的存在情況，提供一種高效、快捷、準 確的水體小瓜蟲檢測方法，為最終通過小瓜蟲DNA濃度來判斷爆發小瓜蟲病的可能性奠定 基礎，用以指導實際的養殖操作。
[0005] 為實現上述目的，本發明提供了一種快速檢測水體中小瓜蟲方法，包括以下步驟：
[0006] 步驟1:根據養殖水域大小，采集水樣；
[0007] 步驟2:將水樣進行處理后，提取水體中的總DNA;
[0008] 步驟3:利用核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R作為引物進行PCR擴增，得到PCR產物 750bp，電泳檢測；
[0009] 步驟4:將上述PCR產物切膠回收，連接載體后轉入大腸桿菌DH5a中進行克隆，并盡 可能多的挑取單克隆個體進行測序；
[0010] 步驟5:利用DNAMAN6.0軟件對測序結果進行比對，找出小瓜蟲與測得的相似種之 間的差異位點并設計出至少2對針對小瓜蟲的巢氏PCR引物；
[0011] 步驟6:利用上述引物對步驟3得到的PCR產物進行巢氏PCR，知道電泳檢測結果顯 示，有小瓜蟲可擴增出條帶，即可完成對水體中小瓜蟲的檢測。
[0012] 所述步驟1的采集水樣為所需檢測的養殖池池底、池壁不同范圍內水樣或水塘排 水口不同時間段的水樣等體積混合物。
[0013] 所述步驟2中的水樣處理為對所述水樣采用25μπι濾膜進行真空抽濾，抽濾后將所 述的濾膜放入裝有35ml無菌水的50ml離心管中，于禍旋振蕩器上震蕩混勾，8000rpm離心 5min，收集沉淀于-20°C保存;對沉淀物加入新的無菌水，反復吹洗后，裝于1.5ml的離心管 中，lOOOOrpm離心5min，棄上清備用。
[0014] 所述步驟2中總DNA的提取采用試劑盒方法，凝膠電泳檢測DNA提取情況后于-20°C 保存備用。
[0015] 所述步驟3中引物核苷酸序列IC-ITS-F和IC-ITS-R分別為IC-ITS-F 5'-GTTCCCCTTGAACGAGGAATTC-3 ' 和IC-ITS-R 5 ' -TTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3 ' WCR擴增條件為： 94°C 預變性 3min，94°C 變性 30s，55°C 退火 30s，72°C 延伸 30s，30 個循環，72°C 延伸 lOmin;
[0016] PCR擴增反應體系為每25μ1 體系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，濃度為lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0017] 電泳檢測上述PCR產物于1 %的瓊脂糖凝膠中，電壓120V電泳15min，最后在凝膠成 像系統上拍照即可完成電泳檢測。針對小瓜蟲的巢氏PCR引物為2對，分別為n-ICl-F和n-ICl-R;n-IC2-F 和 n-ICl-R。經檢測第一對引物(n-ICl-F 和 n-ICl-R)擴增 PCR 產物447bp，第 二對引物(n-IC2-F和n-ICl-R)擴增PCR產物為225bp。
[0018] 所述步驟4中挑取的單克隆個體20-40個，最后測序得到序列為15個。
[0019] 所述步驟6中，巢氏PCRPCR擴增條件為：94°C預變性3min，94°C變性30s，55°C退火 30s，72°C 延伸 30s，30 個循環，72°C 延伸 lOmin;
[0020] PCR擴增反應體系為每25μ1 體系中：lOxbuffer 2.5yl，MgCl2(25mM)3yl，dNTPs (2·5πιΜ)2μ1，濃度為lOOpmol/μΙ的正反引物各0·5μ1，模板DNA lyl，Taq酶（5υ/μ1)0·25μ1， ddH20 15.25μ1；
[0021] 本發明將環境分子生物學技術原理應用于養殖調查，在獲取小瓜蟲DNA時，只需在 目標水體一定范圍、時間內進行水樣采集即可，快速、簡便、及時的了解了水體中小瓜蟲的 存在情況，解決了小瓜蟲病源發現難的問題，為最終通過水體小瓜蟲DNA濃度測算小瓜蟲病 爆發幾率奠定基礎，以解決小瓜蟲病發現時由于病情嚴重治療難的問題。相對于傳統小蟲 病的防治方法來講，具有創新性，避免了藥物治療方法帶來的藥物殘留，物理治療方法的效 果不佳，生物治療方法時間長的問題，防患于未然，極大的降低了小瓜蟲病的爆發機率。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明實施例的方法流程圖。
[0023] 圖2為本發明方法靈敏度檢測、自然水體爆發小瓜蟲過程、不同養殖水體小瓜蟲存 在情況的DNA提取結果圖。
[0024] 圖3為本發明實施例使用IC-ITS-F和IC-ITS-R對上述三種情況下的小瓜蟲DNA進 行第一次PCR的結果圖。
[0025] 圖4為本發明實施例使用n-ICl-F和n-ICl-R對上述三種情況下的小瓜蟲第一次 PCR產物巢氏PCR的結果圖。
[0026] 圖5為本發明實施例使用n-IC2-F和n-ICl-R對上述三種情況下的小瓜蟲第一次 PCR產物巢氏PCR的結果圖。
[0027] 圖6為通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的小瓜蟲及相似種的序列，圖中方 框表示為針對小瓜蟲特異位點設計的2對特異性引物(n-ICl-F/n-ICl-R;n-IC2-F/n-ICl-R);其中，圖6-ln-ICl-F為上游引物、6-2n-ICl-R為下游引物；圖6-3n-IC2-F為上游引物、6-4n-ICl-R為下游引物。
【具體實施方式】
[0028] 為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，下面對本發明的具體實施方法作進一 步說明。
[0029] 附圖2、3、4、5電泳圖泳道點樣順序依次為:5個/L小瓜蟲，10個/L小瓜蟲，15個/L小 瓜蟲，25個/L小瓜蟲，40個/L小瓜蟲，補充水源，銅魚，空白對照，DNAMarker，第一階段水樣， 第二階段水樣，第三階段水樣，第四階段水樣，第五階段水樣，空白對照，DNAMarker，認養喂 養車間6號池水樣，尾灘1號塘水樣，尾灘3號塘水樣，板房玻纖缸養殖池水樣，第四車間5號 池水體，空白對照，DNAMarker。
[0030] DNAMrker條帶大小從下往上依次為：100bp; 250bp; 500bp; 750bp; lOOObp; 2000bp; 3000bp；5000bp〇
[0031] 附圖6為通用引物ITS-F/ITS-R第一次PCR后得到的，小瓜蟲及相似種的序列，共10 個，其序列見SEQUENCE LISTING。
[0032] 實施例1
[0033] 方法靈敏度檢測
[0034] 為了確定本發明可以有效的提取水體中的小瓜蟲DNA，取嚴重感染小瓜蟲的魚體 (魚體表面有很多小白點），用蒸餾水清洗魚體三遍，用載玻片輕輕刮取魚體表面的白色包 囊，將包囊連同其內的多子小瓜蟲收集到無菌培養皿中，靜置，吸取大量黏液于另一無菌 培養皿中并反復吹洗，將包裹在粘液中的小瓜蟲分離出來，除去黏液。至此2個培養皿中存 在大量可供挑選的小瓜蟲單個蟲體(若黏液較多可再次重復上述操作以獲取更多量的單獨 蟲體）。將5、10、15、25、40個小瓜蟲分別放置與11^水中，按如圖1所示實驗流程進行實驗，使 用濾膜孔徑為25μπι的真空抽氣栗對5個水樣進行抽濾處理，將濾膜放入50ml的離心管中，于 禍旋振蕩器上震蕩混勾，8000rpm離心5min，倒去上清，加入新的無菌水，反復吹洗后吸入至 1.5ml的離心管中，lOOOOrpm離心5min，去上清，使用TIANGEN公司生產的試劑盒提取小瓜蟲 總DNA并溶于TE緩沖液中，-20°C保存備用。圖2-A為DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
[0035] 采用IC-ITS-F和IC-ITS-R序列作為通用性