一種快速檢測痰液中結核分支桿菌的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬生物技術領域，涉及一種生物檢測技術，具體涉及一種快速檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的試劑盒。
【背景技術】
[0002]結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見。結核病至今仍為重要的傳染病。據WHO報道，每年約有800萬新病例發生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛生狀態改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結核病的發病率和死亡率大為降低。但應注意，世界上有些地區因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應用、酗酒和貧困等原因，發病率又有上升趨勢。因此，對結核分枝桿菌的及時、高效、特異性的檢測成為預防、治療結核分枝桿菌引起病癥的有效手段。
[0003]細菌培養和涂片檢查是應用最為廣泛的病原學診斷技術之一，其中痰液培養約占50%以上。痰液標本檢驗對于呼吸道疾病的診斷和鑒別具有重要的臨床意義。正常人下呼吸道是無菌的，當人體的肺部或支氣管發生細菌性感染時，痰液分泌量會明顯增加。經痰液細菌培養，分離出病原菌，有助于對下呼吸道感染性疾病的診斷和治療。經痰液培養發現常見的致病菌:
革蘭陽性菌:肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、結核分枝桿菌、放線菌、奴卡菌、厭氧球菌、白喉棒狀桿菌等；
革蘭陰性菌:卡他布蘭漢菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、假單胞菌、軍團菌等。
[0004]傳統習慣程序的痰液標本細菌學檢驗其臨床符合率并不高，其原因是多方面的。除了痰標本采集不規范導致的不合格標本帶來的培養結果與病人感染不相符外，還因為微生物和人體的相關性本身就具有復雜性:源自細菌的致病與條件致病的辨證性，如致病菌可能為正常攜帶，而細菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發生單純定植或感染，要證明培養結果與感染的相關性是醫學微生物學所面臨的難題，這也使得一直以來在對于痰培養的標準化進展十分緩慢。
[0005]痰液細菌培養陽性率普遍較低，臨床符合率差的關鍵因素是痰標本采集不規范，不合格痰標本將直接導致病原菌被分離的機會降低，大量正常菌群也會抑制病原菌的生長或干擾病原菌的檢出，降低了臨床符合率;再有就是操作程序的不規范，不重視直接涂片，檢驗過程控制的不嚴密;且痰液中細菌的種類很多，它們的生理特性和所需要的培養條件不盡相同。如果要采用培養的方法技術食品中所有的細菌種類和數量，必須采用不同的培養基及培養條件，其工作量很大，以上均為導致臨床符合率低的重要原因。
[0006]國內外對結核分枝桿菌的檢測試劑主要基于抗體檢測、核酸檢測和藥敏培養基檢測等。目前，核酸檢測已成為結核分枝桿菌檢測的主要方法;對結核分枝桿菌的核酸檢測主要有以下類型:PCR-熒光探針法、環介導恒溫擴增法、熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法、DNA微陣列芯片法等。
[0007]由于抗體檢測靈敏度較低、假陽性現象較多，核酸檢測需要熒光PCR儀等大型儀器，且需事先對病原菌進行核酸提取、后續熒光檢測耗時較長等特點，一種儀器應用廣泛廉價、操作簡便、結果判定直觀、靈敏度高的檢測方法呼之欲出。
[0008]焚光原位雜交(FluorescenceIn Situ Hybridizat1n, FISH)是一種分子細胞遺傳學技術，是20世紀80年代末期發展起來的一種非放射性原位雜交技術。FISH的基本原理是用熒光標記的單鏈核酸為探針，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行特異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。可用熒光標記的探針直接與染色體進行雜交從而對基因進行染色體定位。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體結構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。
[0009]分子信標(molecular beacon)是一種基于焚光共振能量轉移原理設計的一種新型核酸熒光探針，其與靶序列結合會發生結構的變化從而影響熒光信號，因其檢測具有高靈敏性、高特異性，且可用于活體實時檢測，因而被廣泛應用于生物學等諸多領域。
[0010]在病原菌遺傳信息中，以16SrRNA基因為代表的核糖體RNA基因是病原菌上編碼核糖體RNA(rRNA)相對應的DNA序列，存在于所有病原菌的基因組中。該基因具有高度的保守性和特異性以，對以16S rRNA基因為代表的核糖體RNA檢測技術已成為病原菌檢測和鑒定的一種強有力工具。
[0011]本發明有效擬合了熒光原位雜交技術、分子信標技術、熒光顯微鏡技術的優點，對痰液樣本中的結核分枝桿菌進行直接、簡便、有效的檢測。
【發明內容】
[0012]本發明的目的在于:提供一種快速檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的試劑盒。
[0013]1.本發明的技術方案為:提供一種快速檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的探針、方法和試劑盒。所述探針呈分子信標結構，即探針序列由莖環結構兩部分組成，總長度25?50個堿基，其中中間的環序列部分與細菌中核糖體RNA(16s rRNA,23s rRNA等)序列相匹配，兩端莖部分為5?10個互補的DNA序列，探針的5’-端用熒光基團標記，3’-端用熒光淬滅基團標記，在常溫、游離狀態下探針可自動退火形成發夾結構，熒光基團與熒光淬滅基團由于距離較近而不發出熒光信號，只有當探針與靶序列成功雜交之后，熒光基團與熒光淬滅基團彼此分離，進而發出熒光信號;所述探針是通過核酸雜交的原理檢測痰液中的結核分枝桿菌，結核分枝桿菌分子信標探針序列〈SEQ ID N0.1〉為:
5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’
2.本發明提供了一種用于檢測痰液中結核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括:
(1)權利要求1所述的探針；
(2)液化液；
(3)裂解液；
(4)終止液；
(5)固定液；
所述液化液包括:l%(w/v)PEG，0.6 mM DTT，13.4 mM NaCl,0.3 mM KCl，I mMNaH2PO4,0.1 mM KH2PO4,50 mM EDTA，0.l%(v/v)TritonX_100，50 mM TrisHCl pH8.0；
所述裂解液包括:5 M鹽酸胍，0.2 mM DTT,50 mM EDTA，0.5%(w/v)過硫酸銨，0.1%(ν/v)TritonX-100,10 mM TrisHCl pH7.0；
所述終止液包括50 mM TrisHCl ρΗΙΟ.Ο,Ο.5 M NaCl ,0.1%(ν/ν) NP-40,0.5%(v/v)Triton X-100；
所述固定液包括:5%(w/v)甘油，0.2 M DTmT, 25 mM NaCl，0.3 mM KCl ,0.6 mMNaH2PO4,0.6 mM KH2PO4,50 mM EDTA，10 mM TrisHCl pH7.0。
[0014]本發明提供了一種用于檢測痰液樣本中結核分枝桿菌的方法，所述方法采用上述試劑盒進行檢測，所述方法包括以下步驟:
(a)取待檢痰液樣本，加入到液化液中，樣本與所述液化液的體積比為1:1?1:10，震蕩混勻；
(b)取按步驟(a)操作獲得的液體5?10ul滴至載玻片上，50?65°C烘干5?10 min；
(c)將按步驟(b)操作獲得的載玻片浸入乙醇中5?1011^11，50~65°(3烘干5~10 min；
(d)在按步驟(c)操作獲得的載玻片加樣孔中加入探針5?10ul，置于加熱板中50?65°C避光烘干5?10 min；
(e)將按步驟(d)操作獲得的載玻片浸入終止液中卜60sec，置于加熱板中50?65°C烘干5?10 min；
(f)在按步驟(e)操作獲得的載玻片加樣孔中加入固定液5?20ul，加蓋蓋玻片，用熒光顯微鏡鏡檢觀察，用10 X物鏡觀察計數，用4