一種家禽原始生殖細胞的尼羅紅染色方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別是一種家禽原始生殖細胞的尼羅紅染色方法。
【背景技術】
[0002]禽類原始生殖細胞(Primordial Germ Cells，PGCs)是一類具有獨特的迀移路線的細胞，其起源于X期的胚盤上胚層，經下胚層移動到原條期的生殖新月部位，后進入胚胎血管系統，隨血液循環迀移至生殖原基附近定居，同時分化成精子或卵子。
[0003]研究表明，發育不同時期的與冷凍保存的PGCs均具有迀移、分化的能力，基于此，可以利用PGCs制備種系嵌合體，使供體PGCs能分化成有功能的配子，進而獲得純合的PGCs供體后代，實現家禽遺傳資源的長期保存與保護，此外，科研人員還利用體外分離培養的PGCs，通過制作嵌合體為手段進行動物發育、分化及轉基因動物等多方面的研究，因此，PGCs在禽類遺傳資源保存、禽類發育分化等方面都有廣泛的研究和應用價值。
[0004]目前，PGCs的鑒定方法主要有以下三種:一是形態學觀察，即利用PGCs比一般體細胞較大、含有脂肪滴顆粒的特點進行鑒定;二是利用組織化學方法PAS染色，該法又稱過碘酸雪夫染色或糖原染色；三是抗原抗體染色，常用的抗體有antiSSEA-l、antiEMA-l和antiCVH。但是這三種方法在實踐中都存在各種弊端，形態學觀察只是一種輔助觀察，不能作為細胞鑒定的方法，PAS只能鑒定發育到4期以后的PGCs(4期前的PGCs不含有糖原)，而抗原抗體染色存在反應非特異性，即陽性反應的有一部分并非是PGCs，而且染色方法耗時長，可重復性亦不理想。
[0005]尼羅紅染料是檢測細胞內脂肪滴的經典染料，常用于脂肪細胞的特異染色，利用尼羅紅染料進行脂肪細胞染色時，一般在染色前將脂肪細胞用1.5%戊二醛進行固定，然后再利用0.1-0.01mg/mL的尼羅紅染色5分鐘;若以這種方法直接對PGCs進行染色，則可能會因為原始生殖細胞與脂肪細胞存在細胞種類上的差異，而導致染色效果達不到要求，因此目前尚未見利用尼羅紅染料對家禽原始生殖細胞進行染色的相關報道。
【發明內容】
[0006]針對上述問題，本發明提供一種利用尼羅紅染料對家禽PGCs進行染色鑒定的方法，具有快速、簡便、穩定的特定，本發明是這樣實現的:
一種家禽原始生殖細胞的尼羅紅染色方法，其具體步驟如下:
(1)將lmg/mL的尼羅紅/甲醇溶液用不含鈣鎂離子的I3BS稀釋100倍后，加入PGCs細胞中，吹打形成懸浮的單個細胞，接著室溫避光染色5-10 min；
(2)1500rpm離心5分鐘，取沉淀以不含鈣鎂的I3BS清洗；
(3)將Hoechst33342溶液用不含鈣鎂的PBS稀釋至10yg/ml，加入沉淀中，室溫避光染色2 min，即完成對原始生殖細胞的染色。
[0007]進一步，本發明所述家禽原始生殖細胞的尼羅紅染色方法中，所述PGCs細胞是這樣獲得的:取發育至55-60 h的雞胚或發育至3.5-4 d的鵝胚，從卵黃靜脈中采集血液;然后放入含有10% FCS的TCM199離心管中，3000 rpm，離心5 1^11，取沉淀加入0.1 mL的TCM 199，再加入0.9 mL16% Ficoll，混勻后加入0.2 mL 6.3%的Ficoll，800Xg離心30 min;移走離心管表面10yL液體，接著取離心管表面200yL液體溶于300 yL的TCM199中，1500 rpm離心5min;取沉淀再溶于300此的TCM199中，如此重復三次，第四次離心獲得的沉淀即為純度為50-70%的PGCs；
進一步，本發明所述家禽原始生殖細胞的尼羅紅染色方法中，所述PGCs細胞是這樣獲得的:取發育至6-7d的雞胚或發育至8-9d的鵝胚，采集胚胎的兩側生殖腺;用不含鈣鎂離子的PBS將0.25%胰蛋白酶-EDTA稀釋3倍，然后將采集到的生殖腺置于稀釋后的胰蛋白酶_EDTA中，37°C消化5 min，最后加入DMEM終止消化，于1500 rpm離心5分鐘，取沉淀加入KnockOut DMEM，置于37°C、5% CO2環境中培養3-4 h，最后收集培養液，1500 rpm離心5min，即獲得純度為60-80%的PGCs。
[0008]與現有技術相比，本發明提供的尼羅紅染色方法，適用于固定的原始生殖細胞和活的原始生殖細胞，染色步驟簡單、快速，染色效果穩定，可重復性高的優點;本發明首次將尼羅紅染料用于鑒定原始生殖細胞，彌補了現有鑒定方法試劑價格昂貴、操作時間長、實驗結果不穩定等缺陷，適宜廣泛推廣應用。
【附圖說明】
[0009]圖1為雞胚與鸛胚的血管分布顯微鏡圖；
其中圖1A為發育至55-60 h的雞胚血管分布圖，圖1B為發育至3.5-4 d的鸛胚血管分布圖，圖中箭頭所示為雞胚與鵝胚的卵黃靜脈。
[0010]圖2為血液中分離的PGCs顯微鏡圖；
其中，圖2A為雞胚血液中分離的PGCs，圖2B為鵝胚血液中分離的PGCs，圖片右上角為放大的單個原始生殖細胞。
[0011 ]圖3為雞胚與鵝胚的生殖腺顯微鏡圖；
其中，圖3A為雞胚生殖腺顯微鏡圖，圖3B為鵝胚生殖腺顯微鏡圖。
[0012]圖4為生殖腺中分離的PGCs顯微鏡圖；
其中，圖4A為雞胚生殖腺中分離的PGCs顯微鏡圖，圖4B為鵝胚生殖腺中分離的PGCs顯微鏡圖。
[0013]圖5為雞血液PGCs的尼羅紅染色結果示意圖；
其中，圖5A為明場下PGCs，圖5B為尼羅紅染色后PGCs呈綠色熒光，圖5C為Hoechst33342染色后PGCs呈藍色熒光，圖為圖5B與圖5C的疊加圖。
[0014]圖6為雞生殖腺PGCs的尼羅紅染色結果示意圖；
其中，圖6A為明場下PGCs，圖6B為尼羅紅染色后PGCs呈綠色熒光，圖6C為Hoechst33342染色后PGCs呈藍色熒光，圖6D為圖6B與圖6C的疊加圖。
[0015]圖7為鵝血液PGCs的尼羅紅染色結果示意圖；
其中，圖7A為明場下PGCs，圖7B為尼羅紅染色后PGCs呈綠色熒光，圖7C為Hoechst33342染色后PGCs呈藍色熒光，圖7D為圖7B與圖7C的疊加圖。
[0016]圖8為鵝生殖腺PGCs的尼羅紅染色結果示意圖；
其中，圖8A為明場下PGCs，圖8B為尼羅紅染色后PGCs呈綠色熒光，圖8C為Hoechst33342染色后PGCs呈藍色熒光，圖8D為圖8B與圖8C的疊加圖。
[0017]圖9為雞生殖腺PGCs特異抗體染色結果示意圖；
其中，圖9A為明場下PGCs示意圖，圖9B為特異免疫熒光染色后PGCs呈紅色熒光示意圖，圖9C為Hoechst 33342染色后PGCs呈藍色熒光，圖9D為B與C的疊加圖。
【具體實施方式】
[0018]以下通過具體實施例對本發明做進一步說明。
[0019]種蛋來源:
實施例中使用的雞種蛋購于揚州翔龍禽業發展有限公司，品種為蘇禽綠殼蛋雞;鵝種蛋購于常州陽湖鵝業專業合作社，品種為揚州白鵝。
[0020]試劑、培養基來源:
實施例涉及的DMEM培養液、TCM199、Knock0ut DMEM均購自Invitrogen公司；
Ficoll 400、Hoechst 33342、多聚甲醛、BSA、Triton X-100、尼羅紅染料均購于Sigma公司；
兔多克隆抗體anti_DDX4(MVH antibody)、Cy3標記的山羊抗兔IgG均購于abeam公司； 合成小鼠SCF與合成人FGF購于R&D生物公司；
定性濾紙購于GE公司；
微針購于Orig1公司；
24孔培養板購于Corning公司；
除非特殊說明，所涉及試劑均是由商業途徑購買；
Ficoll 400的配制:將0.63 g Ficoll 400溶于 10 mL含有 10% FCS(V/V)的TCM 199中，SP配成6.3%(W/V)的Ficoll 400;將1.60 g Ficoll 400溶于 10 mL含有 10% FCS(V/V)的TCM199中，即配成 16%(W/V)的Ficoll 400；
KnockOut DMEM: 40% BRL條件化KnockOut DMEM，7.5% FCS , 2.5% 雞血清，2 mMGlutaMax，l X非必須氨基酸，I mM丙酮酸鈉，0.1 mM β_巰基乙醇，1%青鏈霉素，6 ng/mL合成小鼠SCF，4ng/mL合成人FGF，抽濾除菌4°C保存備用；
自配 Ca2+/Mg2+ free PBS (IL): NaCl 8g，KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g, KH2PO4 0.24g，HCl調pH值至7.2，高壓滅菌，4°C保存；
尼羅紅/甲醇溶液配制:將購買的尼羅紅染料溶解于甲醇中，終濃度為lmg/mL，4°C避光保存；
Hoechst33342溶液:將購買的Hoechst33342溶解于三蒸水中，終濃度為10mg/mL，4 °C避光保存；
4%多聚甲醛配制:4 g多聚甲醛加入到100 mL不含鈣鎂離子的PBS中，60 °C加熱溶解，4
°C保存；
含有1%BSA的I3BS液:1 g BSA加入到100 mL不含鈣鎂離子的PBS中，溶解后過濾除菌，4
°C保存；
0.1%Triton父_100:將0.1 mL Triton X-100加入到100 mL不含鈣鎂離子的PBS中，過濾除菌，4 °C保存；
PBS-T溶液:將0.05 mL Tween 20加入到100 mL不含鈣鎂離子的I3