一種發酵生產兩性霉素b的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于發酵工程領域，具體涉及一種發酵生產兩性霉素 B的方法。
【背景技術】
[0002] 兩性霉素 B是由結節性鏈霉素發酵產生的，由37個碳原子構成的多烯大環內酯類 抗生素，臨床用于治療由多種深部真菌如白色念珠菌、新型隱球菌、曲霉菌等引起的心臟或 全身感染。對某些嚴重的深部真菌病如新生隱球菌腦膜炎、侵襲性曲霉病，特別是對免疫缺 陷或嚴重粒細胞缺乏的患者的治療以及某些地方性真菌病如球孢子菌病、組織胞漿菌病、 皮炎芽生菌病等仍需應用兩性霉素 B，兩性霉素 B仍然是治療侵襲性真菌感染的一線藥物及 "金標準"。
[0003] 兩性霉素 B為多烯大環內酯類抗生素，其生物合成途徑為PKSI，可以分解為活化前 體的生成（乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A)、內酯環的生成（多聚乙酰途徑)和氨基糖的形成。在 兩性霉素 B的生物合成途徑中，內酯環的形成是限制性因素。內酯環的形成是以乙酸為起始 單位、丙二酸為延續單位通過聚酮體途徑縮合而成，這表明兩性霉素 B生物合成的重要前體 物質是短鏈脂肪酸，這些脂肪酸前體物不易被菌體合成，因而成為限制兩性霉素 B生物合成 的決定性因素。在兩性霉素 B發酵過程中加入前體物質是提高發酵單位的重要手段，通過補 加前體物質，可以達到控制兩性霉素 B產生菌的生物合成方向及增加兩性霉素 B產量的目 的。從外界補加前體物質，能明顯地提高兩性霉素 B的發酵水平。但是，外源性前體物質在發 酵液中的殘留濃度過高，會使生產菌株中毒，不利于兩性霉素 B的生物合成;而前體物質不 足也會大大影響兩性霉素 B的生產。因此，研究加入何種前體物質以及添加策略對兩性霉素 B的高產穩產具有重要的意義。
[0004] 工業發酵過程的調控往往是一個復雜的多因素問題，直接影響到發酵效價及目的 產物的生產，是工業發酵中最核心的問題之一。利用微生物發酵生產兩性霉素 B，其培養基 成分相當復雜。影響微生物代謝的因素除培養基成分外，還包括pH值、溫度等操作條件，可 變因子較多。因而選擇合適、高效的優化方法顯得尤為重要。
[0005] 有機氮源作為一種成分復雜而且組分不容易定量的培養基原料，對發酵過程影響 很大。長期以來，工業發酵大都采用玉米漿等大宗農副產品作為有機氮源，不同廠家、不同 批次有機氮源組分之間存在不穩定性和差異性，所以導致不同批次發酵代謝產物及代謝水 平不一致，因此有機氮源的選取和使用是非常關鍵的。
[0006] 因此，如何調整兩性霉素 B發酵培養基的成分以及發酵條件，加入何種前提物質， 加入的量以及加入時機的選擇，成為如何提高微生物發酵生產兩性霉素 B產量的所迫切需 要研究的課題。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是解決現有技術中微生物發酵制備兩性霉素 B存在的發酵過程不穩 定及發酵水平低的問題，提供一種通過優化發酵培養基配方、發酵條件，在發酵過程中添加 前體物質，促進兩性霉素 B的生物合成，來提高兩性霉素 B產量的方法。
[0008] 本發明的關鍵構思為:采用結節性鏈霉素菌株為出發菌株，在微生物發酵生產兩 性霉素 B的過程中，優化初始pH值、發酵溫度及時間、接種量等條件，優化新型復合有機氮 源，在兩性霉素 B產物合成初期，添加前體物質，提高兩性霉素 B的產量。
[0009] 本發明所提供的一種發酵生產兩性霉素 B的方法，包括以下步驟： a、制備結節性鏈霉素菌株的種子液 將結節性鏈霉素菌株的斜面培養物或孢子液接種于種子培養基，26_30°C、在搖瓶或發 酵罐中培養44-52 h獲得種子液。
[0010]其中所述的種子培養基按以下方法制得：玉米淀粉20.0-30.0克、葡萄糖10.0-20.0克、熱榨黃豆餅粉10.0-20.0克、酵母粉5.0-10.0克、玉米漿2.0-8.0克、氯化鈉1.0-2.0 克、碳酸鈣3 · 0-4 · 0克，加水定容至 1000mL，pH7 · 0-7 · 5，121°C滅菌30min。
[0011] 本發明所述兩性霉素 B產生菌可選用菌種編號ATCC14899的菌種。
[0012] b.制備結節性鏈霉素菌株的發酵液 將上述種子液以體積百分比6-15 %的接種量接種于發酵培養基，在搖瓶或發酵罐中發 酵，發酵24-50小時之間加入前體物質丙酸鈉或正丙醇，繼續發酵，總發酵時間120-140 h， 發酵溫度26 -30 °C，得到發酵液。
[0013] 其中所述發酵培養基按以下方法制得:葡萄糖20.0-40.0克、玉米粉20.0-30.0克、 熱榨黃豆餅粉0-20.0克、棉籽蛋白粉0-30.0克、酵母粉0-10.0克、玉米漿5.0-8.0克、磷酸二 氫鉀0 · 5-0.8克、氯化鈉1 · 0-2 · 0克、碳酸鈣3 · 0-6 · 0克，加水定容至1000mL，pH7 · 0-8 · 0，121 °C 滅菌 30min。
[0014] 其中所述步驟b中前體物質添加量為每升發酵液加入0. 4-4克。
[0015] 其中所述前體物質添加時間為發酵30-40小時之間加入。
[0016]其中所述步驟b中棉籽蛋白粉和酵母粉的質量比為6:卜3:1。
[0017] 其中步驟b中所述發酵為壓力為0.05±0.01]^3、攪拌速度為200-400印111，通氣比 為1:0·8-1·2vvm。
[0018] 其中所述種子液以體積百分比8-10%的接種量接種于發酵培養基。
[0019]其中所述種子液在種子培養基中培養46-48小時。
[0020]其中所述發酵培養基的初始最適pH值為為7.3-7.6。
[0021 ]其所述步驟b中中棉籽蛋白粉和酵母粉，比例為5:1 -4:1。
[0022]上述優選條件，所獲得兩性霉素 B的產量從7131 ug/ml提高到14469ug/ml，為兩性 霉素 B的工業化生產提供了一種新的方法。本發明中通過優化發酵配方、新型復合有機氮源 和發酵條件，保證了不同發酵批次間代謝產物及發酵水平的一致性;加入前體物質后可顯 著促進兩性霉素 B的生物合成。優化后兩性霉素 B產量提高103%，發酵時間縮短14%，提高了 產能，縮短了生產周期，降低了能耗及三廢排放。
【具體實施方式】
[0023]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于 此。下述實施例中所用的實驗材料如無特殊說明均為工業級原料;所用的棉籽蛋白粉由青 島科瑞提供，酵母粉由安琪酵母有限公司提供，丙酸鈉、正丙醇由天津永大化學試劑有限公 司提供。
[0024] 實施例1、10L自動發酵罐發酵制備兩性霉素 B 結節性鏈霉素菌株種子液的制備 將結節性鏈霉素菌株的斜面培養物或孢子液接種于種子培養基，26°C、220 rpm、培養 48 h獲得種子液； 其中所述的種子培養基按以下方法制得:玉米淀粉20.0克、葡萄糖20.0克、熱榨黃豆餅 粉10.0克、酵母粉10.0克、玉米漿8.0克、氯化鈉1.0克、碳酸鈣3.0克，加自來水定容至 1000mL，pH7 · 0，121°C 滅菌 30min。
[0025] 本發明所述兩性霉素 B產生菌為菌種編號ATCC14899的菌種。
[0026]發酵培養基組成： 葡萄糖280.0克、玉米粉140.0克、熱榨黃豆餅粉140.0克、玉米漿35.0克、磷酸二氫鉀 3.5克、氯化鈉7.0克、碳酸鈣28克，加自來水定容至7000mL，pH7.0，121°C滅菌30min，10L自 動發酵罐發酵培養。
[0027] 發酵條件:罐內的壓力為0.05MPa，通氣比為1:1. Ovvm，裝料量為7L，種子培養46小 時后接種，接種量為10%，培養溫度為26°c，轉速為300 r/min。在發酵培養開始24小時后加 入丙酸鈉，每升發酵液加入0.4 g，發酵培養140小時。
[0028] 結果見表1，在優化的發酵條件下，采用傳統的黃豆餅粉作為有機氮源，在發酵過 程中加入前體物質，發酵結束后，兩性霉素 B的發酵單位為8557ug/ml。
[0029] 實施例2、5L自動發酵罐發酵制備兩性霉素 B 結節性鏈霉素菌株種子液的制備 將結節性鏈霉素菌株的斜面培養物或孢子液接種于種子培養基，28°C、220 rpm、培養 46 h獲得種子液； 其中所述的種子培養基按以下方法制得:玉米淀粉30.0克、葡萄糖10.0克、熱榨黃豆餅 粉15.0克、酵母粉8.0克、玉米漿5.0克、氯化鈉2.0克、碳酸鈣4.0克，加自來水定容至 100〇11^，？!17.5，121°(3滅菌3〇11^11。
[0030] 本發明所述兩性霉素 B產生菌為菌種編號ATCC14899的菌種。
[0031 ]發酵培養基組成： 葡萄糖90.0克、玉米粉90.0克、棉籽蛋白粉90.0克、酵母粉15.0克、玉米漿18.0克、磷酸 二氫鉀2.1克、氯化鈉4.5克、碳酸鈣9克，加自來水定容至3000mL，pH7.5，121°C滅菌30min， 5L自動發酵罐發酵培養。
[0032] 發酵條件:罐內的壓力為0.05MPa，通氣比為1:0.8vvm，裝料量為3L，種子培養46小 時后接種，接種量為8%，培養溫度為28°C，轉速為400 r/min。在發酵培養開始50小時后加入 正丙醇，每升發酵液加入4g，發酵培養120小時。
[0033]結果見表1